论文摘要
研究背景80%的人在一生中曾有过下腰痛困扰,而椎间盘退行性病变是下腰痛常见的病因。对于有症状的椎间盘退变性疾病原则上采用“阶梯疗法”进行治疗,随着椎间盘退变的加剧,治疗阶梯随之上升,治疗费用和副作用相应增加,故宜在椎间盘退变的早期对其进行椎间关节成形（Spine Arthroplasty）,以期保留和重建脊柱运动单元（Functional segment unit,FSU）的生理功能。髓核置换是采用人工髓核假体重建前柱、早期治疗椎间盘退变性疾的一种椎间关节成形技术,具有恢复椎间高度、保留运动等功能,成为脊柱外科研究热点之一。PDN假体（Prosthetic Disc Nucleus）是较早进入临床的亲水性髓核假体,早期能恢复椎间高度、有效维持运动功能,改善临床症状;但是在中长期随访时发现软骨终板损伤（60.0%）、假体下沉（49.2%）等并发症,其主要原因是PDN假体材料过硬、表面积过小导致软骨终板应力集中。因此,人工髓核假体的研制应选用弹性模量适宜的水凝胶、其形状应与软骨终板匹配。本课题在聚乙烯醇（PVA）水凝胶的基础上,复合仙人掌的提炼物果胶,制备果胶/聚乙烯醇复合（Pectin/PVA Composite,CoPP）水凝胶,为成形人工髓核假体的研制提供一种弹性模量适宜的新型水凝胶;并优化设计CoPP水凝胶人工髓核假体的外形与尺寸,实现假体与软骨终板的面面接触、合理传载,为CoPP水凝胶人工髓核假体的研发提供实验依据。研究目的1、探索CoPP水凝胶的制备方法,并表征其微观结构,评价其溶胀性能。2、评价溶胀平衡CoPP水凝胶纵向加载时的静态生物力学性能。3、评价CoPP水凝胶的体外急性细胞毒性及植入动物体内后的局部炎症反应,完成CoPP水凝胶的基本生物相容性评价。4、探索腰椎间盘MRI图像重建髓核三维模型的方法,并完成国人CoPP人工髓核假体三维形状、尺寸的优化设计。研究方法1、选定适宜质量比例的XPV-MC300果胶、PVA-124聚乙烯醇及蒸馏水,经过溶胀、低频振荡加热、冻融,制备成圆柱状PVA水凝胶试件12个、CoPP水凝胶试件24个,随机分为两组,分别观察冻干（Freeze Drying,FD）及无水乙醇（Absolute Ethanol,AE）脱水对PVA、CoPP水凝胶质量脱水率(DRM)、体积脱水率(DRV)的影响。采用红外光谱仪（FTIR）、差示扫描量热仪（DSC）、X射线衍射仪（XRD）、扫描电镜（SEM）,对其微观结构进行表征。经冻干、无水乙醇脱水至恒重的PVA与CoPP水凝胶试件共8个,在37℃、0.10MPa下,分别浸泡于生理盐水（NS）及含10%小牛血清的高糖DMEM细胞培养液中,观察其质量溶胀率(SRM)、体积溶胀率(SRV),并按照公式lg(SRM)=lg（k）+n lg（t）,计算PVA、CoPP水凝胶的溶胀速率常数（k）、扩散特征指数（n）等溶胀动力学参数。采用重复测量数据的方差分析,比较质量脱水率、体积脱水率在不同时间的差异,采用独立样本t检验比较相同时间冻干与无水乙醇脱水方法、PVA与CoPP水凝胶之间的差异。2、将溶胀平衡的圆柱状CoPP、PVA水凝胶试件各4个,在MTS-858 Mini Bionix材料试验机上纵向预加载5次,加载速率5N/s,回零后加载至600N,持续30min后快速卸载,实时记录力、位移、时间;并测量加载前、卸载后24小时内的质量、尺寸。计算以下指标:①将第6次应力、应变行线性拟合,所得一次项系数即为弹性模量;②将第5次加载-卸载数据,利用Origin7.5软件按照横坐标为0～55%、纵坐标为0～2.0MPa（长度比1.25）制出应力-应变曲线,以统一格式导出图像,用Metlab7.0软件计算滞后环面积及上升曲线与横坐标间的面积,两者的比值即为能量吸收率;③外力达到600N时应变为SC,持续加载30min,每隔5min的应变与SC相比,即为归一化蠕变量;④卸载后的质量、体积占加载前试件原始质量、体积的百分比,即为归一化质量与体积百分比。采用独立样本t检验,比较CoPP、PVA水凝胶两者的弹性模量、能量吸收率;采用重复测量数据的方差分析,比较加载前、卸载后即刻、24小时之间的归一化质量及体积百分比;采用独立样本t检验比较PVA与CoPP水凝胶之间归一化质量及体积百分比的差异。3、选用NCTC L929小鼠成纤维细胞进行体外急性细胞毒性试验,分为正常组、阴性对照组（PVA/FD、PVA/AE）、实验组（CoPP/FD、CoPP/AE）、阳性对照组（0.64%苯酚）,定期施加每组的干预因素,观察细胞生长状态,于培养2、4、7d测定OD值、计算相对增殖率（RGR）。此外,选用30只SD大鼠（雌雄各半,体重为182g±13g）,在左、右臀肌内分别植入经无水乙醇脱水的CoPP、PVA水凝胶（10mm*3mm*3mm,长*宽*厚）,观察手术切口及一般情况,于术后1周、4周、12周取材,观察大体标本及经HE染色的组织切片,采用GB/T 161752-1996中炎症细胞反应标准和纤维囊腔分级标准,进行组织反应程度分级,并观察光镜下CoPP水凝胶的微观结构。4、在接受GE Signa Excite 3.0磁共振仪常规检查腰部MRI的患者中,除外创伤、炎症、畸形及前中柱肿瘤等疾患,选取无阳性体征、年龄居于20～50岁、T2加权扫描中椎间盘退变不超过Pfirrmann 2级与Modic分型不超过1级的患者。行层厚1mm～1.5mm、层间距0mm的冠状位或矢状位T2序列扫描,获得DICOM 3.0 MRI图像。将图像导入Mimics10.01软件,完成图像的准确分割,通过Calculate 3D计算,重建髓核的三维模型,分别测量MRI图像、三维模型的髓核矢径、横径、高度及倾斜角。依据重建的髓核三维模型,设计CoPP水凝胶人工髓核假体的形状;结合体积脱水率、溶胀率的计算公式,计算出CoPP水凝胶人工髓核假体制备时的体积(Vpre)、脱水状态植入时的体积(Vimp)与人体髓核体积(Vnp)之间的换算系数,将上述两个系数的立方根与人体髓核的矢径、横径、高度相乘,计算出CoPP人工髓核假体植入时的理想尺寸,据此设计出CoPP水凝胶人工髓核假体植入时的型号、尺寸。结果1、聚乙烯醇（25%）、果胶（5%）的水溶液,经过溶胀、低频振荡加热、冻融,成功制备出圆柱状CoPP水凝胶试件。冻干脱水破坏水凝胶的外形,而无水乙醇脱水不破坏水凝胶外形,但是冻干的脱水率显著大于无水乙醇的脱水率。25%PVA水凝胶的质量脱水率、体积脱水率,显著大于同种脱水方法下的CoPP水凝胶。CoPP水凝胶的FTIR谱图、XRD图是PVA和果胶两者的叠加;CoPP水凝胶的DSC曲线中有两个熔融峰,分别在182.6℃和225.1℃处,后者与PVA粉末的结晶熔融峰对应;经冻干、无水乙醇脱水CoPP水凝胶的断面,在扫描电镜下均可见孔隙形成,孔径在10μm～50μm之间,其内含有颗粒;而同样条件下的PVA水凝胶断面,未发现明显的孔隙形成。CoPP水凝胶的扩散特征指数（n）接近0.5,CoPP水凝胶的溶胀速率常数（k）、以及溶胀平衡时的质量溶胀率（197.38%～252.49%）、体积溶胀率（241.47%～308.93%）,均显著大于PVA水凝胶。2、在纵向加载-卸载试验过程中,CoPP水凝胶、PVA水凝胶试件均未出现破坏,其应力-应变曲线可分为相对平缓的起始段、相对陡峭的上升段,呈非线性表现。CoPP水凝胶全段应力.应变曲线拟合后的弹性模量为（2.76±0.09）MPa,与成形髓核假体适宜的3 MPa接近;显著小于PVA水凝胶的（4.89±0.61）MPa。在加载-卸载的应力-应变曲线中,CoPP、PVA水凝胶均出现应变滞后于应力现象,形成滞后环,其对应的能量吸收率,CoPP水凝胶为12.50%±1.47%,PVA水凝胶为8.57%±1.78%,两者差异显著。持续加载30min,CoPP、PVA水凝胶均达到蠕变平衡,其归一化蠕变量分别为1.076±0.005、1.105±0.030。卸载后即刻,CoPP水凝胶归一化质量百分比为（97.67±0.98）%,显著小于PVA水凝胶的（99.15±0.18）%。卸载后24小时,CoPP、PVA水凝胶归一化质量百分比、体积百分比,与加载前无差异。3、阴性对照组（PVA/FD、PVA/AE）、实验组（CoPP/FD、CoPP/AE）中的L929细胞,呈长梭形,与正常对照组同时贴壁,圆形细胞均小于10%,胞浆内可见离散颗粒,极个别细胞出现溶解,随着培养时间的延长,均出现接触性生长抑制。阳性对照组中的L929细胞几乎全部为圆形、体积减小,无贴壁,无明显细胞增殖。CoPP组RGR均大于75%,PVA组RGR超过80%,细胞毒性小于1级;阳性对照组RGR小于24%、细胞毒性为4～5级。所有SD大鼠于术后2～6小时苏醒、开始活动,无死亡,手术切口无红肿、渗出、化脓等炎症表现,均一期愈合。在植入1周时,PVA、CoPP水凝胶的体积较植入时明显增大、在肌袋内可活动,肌肉色泽鲜红、局部无脓性分泌物。病理切片显示:PVA、CoPP组局部组织的炎性细胞反应为Ⅳ级、未形成完整囊腔;CoPP水凝胶呈嗜碱性、染色较深,孔隙较多、孔径大,PVA水凝胶近中性、染色浅,孔隙少、孔径小。在植入4周时,PVA、CoPP水凝胶在肌袋内基本无活动,局部组织结构无异常,炎性细胞反应为Ⅰ级,囊腔反应为Ⅳ级;PVA、CoPP水凝胶的染色、结构无变化。在植入12周时,PVA、CoPP水凝胶的体积、外观与前2次取材时相似,炎性细胞及囊腔反应均为Ⅰ级;CoPP水凝胶断面仍为嗜碱性深染,其边缘连续、无明显缺损;孔隙丰富,孔隙间的连接与第1周、4周相近,孔内仍可见微小颗粒。4、本实验获取的薄层MRI图像,采自一名34岁女性,冠状位脂肪抑制T2序列扫描（OCor fS,TE82.7ms,TR4000ms）,包括腰1～骶1椎间盘前、后缘,层厚1.2mm、层间距0mm的连续扫描,像素大小为0.625mm,获得44张DICOM3.0格式的MRI图像。MRI图像上椎间盘为Pfirrmann 1～2级;采用Mimics软件分割图像理想,重建的腰1～骶1髓核模型,其侧视为椭圆,由扁平逐渐变成高耸穹隆状,外形由铁饼状向橄榄球状过渡。MRI图像上髓核矢径、横径与高度,自上而下呈逐渐增大趋势,以横径为明显;所有髓核的平均矢径、横径与高度分别为（20.8±1.5）mm、（34.7±3.5）mm、（9.2±1.1）mm,与3D髓核模型的测量结果相近。CoPP水凝胶假体以完全脱水状态植入,其体积为人体髓核的25.90%～29.29%,其尺寸为人体髓核的63.74%～66.41%。本实验设计出CoPP水凝胶人工髓核假体为近似橄榄球状的椭圆球体,其侧面为椭圆型,分小号（S）、中号（M1、M2）及大号（L）四种,其矢径为13 mm～14mm、横径为20 mm～24mm,高度为5.5 mm～7.0mm。结论1、采用低频振荡、反复冻融可制备果胶/聚乙烯醇复合（CoPP）水凝胶,适宜采用无水乙醇脱水方法脱水。CoPP水凝胶具有一定的结晶度,存在两种结晶区,为多孔结构。CoPP水凝胶具有良好的再水化特性,水分子是以菲克扩散模式渗入,CoPP水凝胶具有溶胀程度大、溶胀速率快的特点,比单一材料的PVA水凝胶具有更好的溶胀性能。2、CoPP水凝胶是一种粘弹性材料,相对于PVA水凝胶而言,具有软而韧、缓冲载荷能力较强、蠕变特性等特点,其弹性模量与成形髓核假体适宜的模量接近:具有较好的渗透性,利于椎间隙内物质转运,适宜于成形替代椎间盘髓核组织。3、CoPP水凝胶的急性细胞毒性不超过1级,在SD大鼠体内组织反应轻,未发生降解,其基本生物相容性良好,可进一步补充慢性毒性、遗传毒性、致癌毒性,完善其生物相容性评价。4、采用腰椎间盘薄层MRI图像,通计算机图像处理技术可成功重建髓核的三维模型。设计出的CoPP水凝胶人工髓核假体近似橄榄球状,与软骨终板形状匹配,有望合理传载;其所占空间较小,利于球窝器械把持,将有望通过后路椎间盘镜系统微创植入椎间隙。