免疫细胞化学染色联合激光扫描共聚焦显微镜技术检测结核抗原在结脑诊断中的价值

论文摘要

目的:结核性脑膜炎（tuberculous meningitis,TBM）,是由结核分枝杆菌引起的中枢神经系统感染性疾病,是结核病中最严重的类型之一,致残率和致死率较高。近年来由于多重耐药结核菌的流行、人类免疫缺陷病毒的感染及贫穷等多种因素的影响,结脑的发病率呈日益回升的趋势。早期诊断、早期治疗是影响预后的关键。但结脑的诊断,尤其是早期诊断比较困难,脑脊液（CSF）中检测到结核分枝杆菌可作为结脑诊断的“金标准”,但涂片抗酸染色和结核菌培养阳性率很低,对临床早期诊断价值有限。目前尚无一种可靠实用的诊断方法能够满足临床诊断的需要。结核分枝杆菌侵入机体后被单核巨噬细胞吞噬,体内首先出现的是结核分枝杆菌特异性抗原,故结核抗原的检测可以作为结核杆菌存在的直接证据。本实验通过对脑脊液单核细胞内的ESAT-6和PPD两种结核抗原的检测,比较两者对结核性脑膜脑炎的诊断价值,为结核性脑膜脑炎的诊断寻求一种更有效的方法。方法:病例组为35例临床诊断为结核性脑膜炎患者,对照组为35例非结核性脑膜炎患者。所有患者均进行脑脊液常规、生化、细胞学检查及阿利新兰染色,并应用免疫细胞化学染色法和免疫荧光双标记染色法检测脑脊液单核细胞内的ESAT-6及PPD抗原,以Shandon Cytospin4离心沉淀仪收集脑脊液细胞。免疫细胞化学染色采用SP法,置于普通光学显微镜下观察,单核细胞的胞浆内有棕黄色或黄褐色颗粒沉积的为阳性,单核细胞的胞浆无色为阴性结果。免疫荧光双标记染色法以Cy5和FITC荧光二抗及4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）分别标记抗ESAT-6单抗、抗PPD多抗及所有细胞核DNA,置于激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）下观察,ESAT-6阳性的单核细胞呈胞核蓝色、胞浆红色;PPD阳性的单核细胞呈现出胞核蓝色、胞浆绿色的完整结构;阴性细胞只出现蓝色的胞核结构。结果:1临床资料结脑患者可表现为发热、头疼、脑膜刺激征阳性、脑局灶体征、意识障碍等,但却乏特异性,不易于其它神经系统疾病相鉴别,合并颅外结核支持结脑的诊断。2脑脊液常规、生化检查结果结脑组,总细胞数平均502.60±457.67×106 /L;白细胞数平均为310.37±292.20×106 /L;葡萄糖平均为1.87±0.87mmol/L;蛋白平均为1.62±0.65g/L;氯化物平均为109.68±9.25mmol/L;腰穿压力平均为277.19±93.56 mmH2O。对照组,总细胞数平均473.63±1545.95×106 /L;白细胞数平均为132.37±293.46×106 /L;葡萄糖平均为2.91±0.95mmol/L;蛋白含量平均为0.76±0.79g/L;氯化物平均为119.25±6.76mmol/L;腰穿压力平均为225.56±122.38 mmH2O。结脑组脑脊液中的白细胞数、蛋白含量较对照组明显升高,P﹤0.05,差异有统计学意义;结脑组葡萄糖、氯化物含量与对照组比较,明显降低, P﹤0.05,差异有统计学意义;脑脊液总细胞数和腰穿压力两组比较差异无统计学意义。3脑脊液细胞学表现结脑组,35例患者中有25例为混合细胞学反应,8例以嗜中性粒细胞反应为主,2例是以淋巴细胞反应为主。对照组,35例患者中有5例为混合细胞学反应,5例以嗜中性粒细胞反应为主,18例以淋巴细胞反应为主,4例呈激活单核样细胞学反应,3例脑脊液细胞学正常。结脑组混合细胞学反应约占71.43% ,明显高于对照组14.29%,混合细胞学反应对诊断结脑有重要的意义,动态观察脑脊液细胞学的变化,对结脑的治疗及判断预后有一定的应用价值。4脑脊液单核细胞内ESAT-6抗原的检测35例结核性脑膜炎患者中,经免疫细胞化学染色有29例阳性,对照组中有2例阳性, ESAT-6抗原的敏感性为82.86%,特异性为94.29%,病例组与对照组比较,P<0.05,差异有统计学意义;经免疫荧光双标记染色病例组中28例阳性,对照组中有1例阳性, ESAT-6的敏感性为80%,特异性为97.14%,病例组与对照组经统计分析P<0.05,差异有统计学意义;两种方法联合检测ESAT-6抗原,病例组中有30例阳性,对照组中有2例阳性,敏感性为85.71%,特异性为94.26%。5脑脊液单核细胞内PPD抗原的检测病例组中,免疫细胞化学染色有30例阳性,对照组中有6例阳性,PPD的敏感性为85.71%,特异性为82.86%,病例组与对照组比较,P<0.05,差异有统计学意义;在免疫荧光双标记染色中有29例阳性,对照组中有5例阳性,PPD的敏感性为82.86%,特异性为85.71%,两组相比较,P<0.05,差异有统计学意义;两种方法联合检测PPD抗原,病例组中有31例阳性,对照组中有8例阳性,敏感性为88.57%,特异性为77.14%。6 ESAT-6及PPD抗原诊断TBM优劣比较免疫细胞化学染色联合免疫荧光双标记染色,检测ESAT-6和PPD抗原,将两者的敏感性和特异性分别进行X2检验,敏感性P>0.05,差异无统计学意义,特异性P<0.05,差异有统计学意义。故两种方法联合检测ESAT-6抗原的特异性大于PPD抗原。结论:结核性脑膜炎患者脑脊液单核细胞内存在结核抗原,结核抗原的检测可为结脑的早期诊断提供有力的依据。免疫细胞化学染色法联合免疫荧光双标记染色法可提高检出率,其检测ESAT-6抗原的敏感性为85.71%,特异性为94.26%;检测PPD抗原的敏感性为88.57%,特异性为77.14%,经统计分析两种方法联合检测ESAT-6和PPD的敏感性无统计学差异,但ESAT-6抗原的特异性大于PPD抗原。最早在发病3天,最晚在发病180可检测出结核抗原。激光扫描共聚焦显微镜可将脑脊液细胞进行断层扫描及三维立体重建,把细胞学研究从表面、单层、静态描述提高到了立体、断层、动态观察的新阶段。

论文目录

• 摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 结核性脑膜炎的研究进展
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历