重庆低海拔虫草种及其活性物质基础研究

论文摘要

虫草为子囊菌亚门（Ascomycotina）核菌纲（Pyrenomycetes）球壳目（Sphaeriales）麦角菌（Clavicipitaceaes）虫草属（Cordyceps）类真菌寄生于昆虫体中,形成的菌虫复合体。至今,发现的虫草有400多种,我国报道的大约有100多种,其中,冬虫夏草为主要药用品种,是一种名贵中药材。近年来,随着冬虫夏草需求量不断增加,导致对野生冬虫夏草掠夺性挖掘,使天然冬虫夏草生态遭受严重破坏,资源濒临绝迹。因此,筛选评价新虫草资源,满足市场需求已是当务之急。我国虫草研究主要集中在高海拔地区种类,低海拔地区虫草种类研究较少。本文重点对重庆低海拔地区新发现的一种虫草的分类学及其活性物质进行了系统研究,主要结果如下:1重庆低海拔虫草分类学研究通过对野外采集的20个虫草样本进行鉴定,发现重庆低海拔虫草为一新种,命名为重庆虫草（Cordyceps chongqingensis sp. nov.）。该虫草寄主是一种鳞翅目夜蛾科的幼虫。虫体大小一般为40-50×5 mm。寄主体表被黄色菌丝层。子座1-3个,生于寄主头部,柄弯曲,25-35×2.5-4 mm;可孕部柱状,与柄有明显界限,黄绿色,25-35×5-7 mm。子囊壳安瓿形,部分埋生,811-1210（-1524）×1127-1343μm。子囊柱状,5-7.5×170-200μm,子囊帽宽度略小于子囊,子囊孢子4个,呈线形,2-3×30-45μm。采用随机取样,对虫草菌进行多途径分离纯化,获一菌株CQM1T,经接种至加富米饭培养基上培养1.5个月,长出与野生虫草完全相同的子座,从而确证CQM1T为重庆低海拔虫草的无性型菌株。采用形态特征鉴定和分子特征鉴定相结合,鉴定重庆低海拔虫草的无性型菌株CQM1T。通过观察CQM1T菌株培养的菌落特征和显微特征,测定其核糖体26S rDNA D1/ D2区和ITS区全序列,确定重庆低海拔虫草的无性型为戴氏绿僵菌（Metarhizium taii）的一种变种,命名为戴氏绿僵菌重庆变种（Metarhizium taii var. chongqingense nov.）CQM1T形态特征鉴定:CQM1T在Sabouraud、PDA和Czapek培养基上,菌落初期白色,茸状,产孢阶段菌落中间呈一丛丛墨绿色的分生孢子堆;常见产孢方式为菌丝侧边直接产生单个瓶梗产孢,或菌丝顶端直接形成长柱形瓶梗产孢,或在一级分生孢子梗上产生两个瓶梗产孢,孢子链状排列;分生孢子有的长椭圆形,中部稍缢缩,两端对称或者一端变细尖,有的呈梭形,两端变尖。将该菌的产孢方式、孢子大小以及菌落形态等与绿僵菌属已知种检索表相比较,有如下几点区别:①产孢方式有三种,以菌丝侧直接产生单瓶梗产单孢子链最常见;②产生的孢子形状不一,同一孢子链存在长椭圆形和梭形两种形状;③分生孢子变幅大,一般和金龟子绿僵菌大孢变种粗细差不多,但长度稍短,同时又比其它绿僵菌长些。因此,此绿僵菌系一新种。CQM1T分子特征鉴定:对CQM1T的核糖体26S rDNA D1/ D2区和ITS区全序列进行测序,得到26S rDNA D1/ D2的序列长度为601 bp,ITS区为553 bp。用邻接法构建了虫草无性型菌株的26S rDNA D1/ D2和ITS区两个系统发育树。在26SrDNA D1/D2区系统发育树上,可以看出与Metarhizium chongqingensis CQM1T的亲缘关系最近的是Cordyceps taiiT,并且,两者在此区域有563bp完全相同。在ITS区系统发育树上,Metarhizium chongqingensis CQM1T的亲缘关系最近的是Metarhizium taii G97017T,并且,两者在此区域的535 bp中相似率为98%。文献报道Metarhizium taii是Cordyceps taii的无性型。因此,重庆低海拔虫草Cordyceps chongqingensis sp. nov.的无性型是绿僵菌,并且根据对其26SrDNA D1/D2和ITS区序列的分析,发现其为戴氏绿僵菌（Metarhizium taii）的一种变种,因此,命名为戴氏绿僵菌重庆变种（Metarhizium taii var. chongqingense nov.）。2 CQM1T菌丝体培养条件研究首先是培养基筛选,参考察氏培养基,分别进行碳源和氮源筛选。结果表明,小分子碳源蔗糖和葡萄糖的效果比多糖糊精和玉米淀粉好,并且葡萄糖的效果最好。但为了减少生产成本,选择最佳碳源为蔗糖,其含量为3%。而有机氮源中,鱼粉效果培养的菌丝量最多。其次是豆饼粉,考虑到成本问题,且0.5%豆饼粉产生的菌丝量与鱼粉相差不大,选用0.5%的豆饼粉。综合碳源和氮源的筛选结果,虫草菌丝体的生长培养基为:NaNO3 0.2%,K2HPO4 0.1%,KCl 0.05%,MgSO4.7H2O 0.05%,FeSO4 0.001%,蔗糖3.0%,蚕蛹粉0.5%,豆饼粉0.5%。其次采用单因素试验和正交试验相结合,对生长温度、pH和摇床转速进行筛选。结果CQM1T菌丝体培养的最佳条件为:温度28℃,pH5.0,转速180 r/min。最优条件下培养,CQM1T在第7d菌丝量达最大,菌丝得率为:35.6 g/L。3 CQM1T抗菌活性物质的发酵条件筛选首先,进行发酵培养基的筛选,在已确定的生长培养基的基础上,分别缺失NaNO3,K2HPO4,KCl,MgSO4.7H2O,FeSO4进行无机盐筛选,结果表明:因子NaNO3和KCl缺失,其最高活性降低;而FeSO4和MgSO4.7H2O缺失对活性影响较小;缺少K2HPO4时,最高活性却有所升高,所以发酵培养基成分去掉K2HPO4,保留KCl和NaNO3。然后,进行碳氮比的筛选,结果,最佳的碳氮比为30:1,并且有机氮源采用蚕蛹粉的所有组的发酵液活性都比豆饼粉高。因此,选用发酵培养基为:NaNO3 0.05%,KCl 0.05%,蔗糖3.0%,蚕蛹粉0.05%。最后,采用单因素试验和正交试验相结合,选用温度、pH和摇床转速为筛选因素进行筛选。结果,摇瓶最佳发酵条件为:温度25℃,pH 6.5,转速200 r/min。在最佳发酵条件下,发酵活性在第6 d达最大,其对枯草芽孢杆菌的抑菌圈为:30.4 mm。4抗菌活性化合物分离纯化及其结构确证经过反复研究,筛选出了抗菌活性化合物A、B的分离纯化方法即发酵液经过大孔树脂脱色、丙酮沉淀、柱层析、正丁醇萃取和HPLC制备获得白色化合物A和B。经理化性质分析和波谱（UV、IR、EI-MS、1H-NMR、13C-NMR）初步解析,化合物A、B均为寡糖类化合物,其结构有待进一步确证。5 CQM1T培养物的其它有效成分分析对重庆低海拔虫草无性型菌株CQM1T菌丝体及培养液中的五种主要有效成分进行了测定,并与其它虫草菌丝体进行了比较,结果表明,CQM1T菌丝体中的虫草酸（甘露醇）、虫草多糖、蛋白质含量及氨基酸总量都高于其它虫草（只北冬虫夏草粗蛋白含量略高于CQM1T）,尤其是虫草酸和虫草多糖的含量要明显高于其它虫草。氨基酸总量基本接近,含有十七种氨基酸,其中谷氨酸含量最高,必需氨基酸含量较丰富,占氨基酸总量的36.45%。因此,单从有效成分组成来看,重庆低海拔虫草完全可以替代日益匮乏的冬虫夏草等,进行菌丝体大规模培养。基于上述,本文对重庆低海拔虫草进行鉴定,是一新种,命名重庆虫草（Cordyceps chongqingensis sp. nov.）。重庆低海拔虫草的无性型进行分离鉴定,确定为戴氏绿僵菌变种,命名为戴氏绿僵菌重庆变种（Metarhizium taii var. chongqingense nov.）。研究表明,该虫草与目前我国研究最多的冬虫夏草相比:①生长条件温和（最适生长温度28℃,冬虫夏草最适生长温度18-20℃）,生长速度快（周期7 d,冬虫夏草为1个月）。②不仅其有效成分（氨基酸、多糖、虫草酸、蛋白质等）含量同冬虫夏草等相似甚至优于其它虫草,更重要的是能产生较强活性的广谱抗菌化合物。本文通过分离、纯化、制备了抗菌化合物A和B,并通过结构初步分析,推测为寡糖结构,为进一步开发利用重庆低海拔虫草资源,奠定了一定的理论基础。

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摘要

ABSTRACT

缩略词

1 绪论

1.1 问题的提出及其研究意义

1.1.1 问题的提出

1.1.2 研究意义

1.2 国内外研究现状

1.2.1 虫草无性型及其分类鉴定

1.2.2 虫草的有效成分及其应用研究

1.2.3 虫草资源的开发利用

1.3 本文研究的目的和研究内容

1.3.1 本文研究的目的

1.3.2 本文研究的主要内容

1.3.3 本文研究的总体路线

1.4 本文研究的创新点

2 重庆低海拔虫草的分类学研究

2.1 引言

2.2 本章技术路线

2.3 材料与方法

2.3.1 实验虫草

2.3.2 主要试剂

2.3.3 主要培养基及配方

2.3.4 主要仪器和设备

2.3.5 重庆低海拔虫草的采集及其有性型鉴定

2.3.6 重庆低海拔虫草无性型分离及其确证

2.3.7 重庆低海拔虫草无性型的形态特征鉴定

2.3.8 重庆低海拔虫草无性型的分子特征鉴定

2.4 实验结果与分析

2.4.1 重庆低海拔虫草有性型鉴定

2.4.2 重庆低海拔虫草的无性型分离及其确证

2.4.3 重庆低海拔虫草的无性型形态特征鉴定

2.4.4 重庆低海拔虫草的无性型分子特征鉴定

2.5 本章小结

T 菌丝体培养条件研究'>3 CQM1^T菌丝体培养条件研究

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 实验菌种

3.2.2 主要试剂

3.2.3 主要培养基及其配方

3.2.4 主要仪器与设备

3.2.5 碳源的筛选

3.2.6 氮源的筛选

T 的生长影响研究'>3.2.7 不同环境因素对CQM1^T的生长影响研究

T 的生长影响研究'>3.2.8 时间对CQM1^T的生长影响研究

3.3 实验结果与分析

3.3.1 碳源的筛选

3.3.2 氮源的筛选

T 的生长影响'>3.3.3 不同环境因素对CQM1^T的生长影响

T 的生长影响'>3.3.4 时间对CQM1^T的生长影响

3.4 本章小结

T 抗菌活性物质发酵条件研究'>4 CQM1^T抗菌活性物质发酵条件研究

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.2.1 实验菌种

4.2.2 主要试剂

4.2.3 主要培养基及其配方

4.2.4 主要仪器与设备

4.2.5 发酵液抑菌活性测定

4.2.6 无机盐的筛选

4.2.7 碳氮比的筛选

T 发酵液抗菌活性的影响研究'>4.2.8 不同环境因素对CQM1^T发酵液抗菌活性的影响研究

T 发酵液抗菌活性的影响研究'>4.2.9 时间对CQM1^T发酵液抗菌活性的影响研究

4.2.10 发酵液的抑菌谱研究

4.3 结果与分析

4.3.1 无机盐的筛选

4.3.2 碳氮比筛选

T 发酵液抗菌活性的影响'>4.3.3 不同环境因素对CQM1^T发酵液抗菌活性的影响

T 发酵液抗菌活性的影响'>4.3.4 时间对CQM1^T发酵液抗菌活性的影响

4.3.5 发酵液的抑菌谱

4.4 本章小结

T 抗菌活性化合物分离纯化与结构分析'>5 CQM1^T抗菌活性化合物分离纯化与结构分析

5.1 引言

5.2 活性化合物的分离纯化技术路线

5.3 材料与方法

5.3.1 实验菌种

5.3.2 主要试剂

5.3.3 主要培养基及其配方

5.3.4 主要仪器与设备

5.3.5 发酵样品制备

5.3.6 发酵液抗菌活性的稳定性初步研究

5.3.7 活性化合物A 的分离与纯化

5.3.8 活性化合物B 的分离与纯化

5.3.9 活性化合物A、B 的薄层色谱图

5.2.10 活性化合物A、B 的HPLC 分析

5.2.11 活性化合物A、B 的结构分析

5.4 结果与分析

5.4.1 发酵液抗菌活性的稳定性

5.4.2 化合物A、B 的分离与纯化

5.4.3 活性化合物A、B 的TLC 图

5.4.4 活性化合物A、B 的HPLC 分析

5.4.5 活性化合物A、B 的结构分析

5.5 本章小结

T 培养物的其它有效成分研究'>6 CQM1^T培养物的其它有效成分研究

6.1 引言

6.2 材料与方法

6.2.1 实验菌种

6.2.2 主要试剂

6.2.3 主要培养基及其配方

6.2.4 主要储液和配方

6.2.5 主要仪器与设备

T 的菌丝及其培养液样品准备'>6.2.6 CQM1^T的菌丝及其培养液样品准备

T 菌丝体和培养液的氨基酸含量测定'>6.2.7 CQM1^T菌丝体和培养液的氨基酸含量测定

T 菌丝体及培养液的粗蛋白含量测定'>6.2.8 CQM1^T菌丝体及培养液的粗蛋白含量测定

T 菌丝体及培养液的粗脂肪含量测定'>6.2.9 CQM1^T菌丝体及培养液的粗脂肪含量测定

T 菌丝体及培养液的多糖含量测定'>6.2.10 CQM1^T菌丝体及培养液的多糖含量测定

T 菌丝体及培养液的甘露醇含量测定'>6.2.11 CQM1^T菌丝体及培养液的甘露醇含量测定

6.3 结果与分析

T 菌丝体和培养液的氨基酸含量'>6.3.1 CQM1^T菌丝体和培养液的氨基酸含量

T 菌丝及培养液的粗蛋白、粗脂肪、多糖、甘露醇含量'>6.3.2 CQM1^T菌丝及培养液的粗蛋白、粗脂肪、多糖、甘露醇含量

6.4 本章小结

7 结论与展望

7.1 主要结论

7.1.1 重庆低海拔虫草的分类学研究

T 菌丝体培养条件研究'>7.1.2 CQM1^T菌丝体培养条件研究

T 抗菌活性物质发酵条件研究'>7.1.3 CQM1^T抗菌活性物质发酵条件研究

T 活性化合物分离纯化及其分子结构分析'>7.1.4 CQM1^T活性化合物分离纯化及其分子结构分析

T 丝体体及培养液其它有效成分分析'>7.1.5 CQM1^T丝体体及培养液其它有效成分分析

7.2 后续研究工作的展望

致谢

参考文献

附录

A. 作者在攻读学位期间发表的论文目录

B. 作者在攻读学位期间取得的科研成果目录

C. 重庆低海拔虫草 26SrDNA D1/D2 和 ITS 区序列

D. 化合物结构分析图谱

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