结缔组织病患者CD4+T细胞甲基化异常的研究

论文摘要

目的:通过研究系统性红斑狼疮（SLE）、系统性硬皮病（SSc）和皮肌炎（DM）患者CD4+T细胞中整体基因组DNA甲基化状态以及甲基化相关调控基因表达,从而探讨结缔组织病的表观遗传学改变。方法:（1）密度梯度离心分离正常人、病人的外周血单个核细胞,磁珠分离CD4+T细胞;（2）试剂盒提取RNA和DNA;（3）整体甲基化定量试剂盒检测CD4+T细胞中整体基因组DNA甲基化水平;（4）实时定量聚合酶链反应（quantitative real-time PCR）检测DNA甲基转移酶（DNMT）和甲基结合蛋白（MBD）的mRNA的表达。结果:（1）与正常对照组相比,SLE和SSc患者CD4+T细胞中均表现出明显的整体基因组DNA低甲基化（P=0.013,P=0.039）,活动性与非活动性SLE患者之间整体基因组DNA甲基化水平无明显差异（P=0.927）;DM患者CD4+T细胞整体基因组DNA甲基化水平与正常对照相比无显著差异（P=0.589）。（2）SLE患者CD4+T细胞中DNMT1及MBD4的mRNA水平较对照组相比明显降低（P=0.001,P=0.008）,MBD2及MeCP2的mRNA水平明显升高（P=0.008,P=0.027）:SSc患者CD4+T细胞中DNMT1,MBD3及MBD4的mRNA水平较正常对照相比显著下调（P=0.001,P=0.002,P=0.021）;DM患者CD4+T细胞中DNMT的表达与正常对照相比没有差异,但其MBD2及MeCP2的mRNA水平明显升高（P=0.046,P=0.000）。（3）SLE患者CD4+T细胞中DNMT1的mRNA水平与整体基因组DNA甲基化水平呈正相关性（r=0.746,P=0.013）;SSc患者CD4+T细胞中MBD4的mRNA水平与整体基因组DNA甲基化水平呈正相关性（r=0.804,P=0.005）。结论:SLE及SSc患者CD4+T细胞基因组DNA甲基化水平低下,DNMT及MBD表达的异常可能在SLE、SSc患者CD4+T细胞DNA低甲基化改变中起作用,从而参与疾病的发病过程。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 前言
• 第二章 材料与方法
• 2.1 研究对象
• 2.2 仪器设备与试剂
• 2.2.1 主要仪器设备
• 2.2.2 主要试剂及耗材
• 2.3 实验步骤
• 2.3.1 外周血单核细胞分离
• 2.3.2 磁珠分离CD4+T细胞
• 2.3.3 RNA抽提
• 2.3.4 逆转录合成cDNA
• 2.3.5 引物设计及合成
• 2.3.6 实时定量PCR
• 2.3.7 DNA抽提
• 2.3.8 CD4+T细胞整体基因组甲基化水平测定
• 2.3.9 实验总流程图
• 2.3.10 统计学分析
• 第三章 结果
• 3.1 SLE、SSC和DM患者CD4+T细胞中整体DNA甲基化水平
• 3.2 SLE、SSC和DM患者CD4+T细胞中DNMT及MBD mRNA表达水平
• 3.3 DNA整体甲基化水平与DNMT及MBD mRAN表达水平的相关性分析
• 第四章 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 综述
• 研究成果
• 致谢