论文摘要
脑血管疾病（cerebrovascular disease,CVD）是指由于各种脑血管病变所引起的脑部病变,是目前人类死亡和残疾的主要原因之一,该疾病的发生主要与脑血流减少和缺血性脑损伤有关。许多继发性因素在缺血后的脑损伤中发挥重要作用。缝隙连接（gap junction）是在两个细胞互相靠近的细胞膜处,各自由6个连接蛋白亚单位形成的半通道（hemichannel）相互连接而形成的。至少21种connexin基因和3种pannexin基因序列编码人的连接蛋白。据报道,脑缺血可使海马神经元pannexinl半通道开放并导致细胞内离子稳态失衡,葡萄糖和ATP等细胞内重要物质泄漏等一系列可引起细胞死亡的事件发生。尽管已知半通道的开放可导致上述严重后果,但是对半通道开放的调控机制还不甚明了,尤其对pannexinl半通道的调控方式及相关信号通路研究少见报道。为了阐明参与调控海马神经元半通道的细胞和分子机制,本研究以离体培养海马神经元缺氧缺糖模型（OGD）、代谢抑制模型（MI）和动物在体局部脑缺血模型（MCAO）为实验对象,从细胞和分子两个层面研究缺血性脑损伤时半通道开放及其调控机制,并对与之相关的信号通路进行了探讨。本研究在建立离体培养海马神经元OGD、MI模型的基础上,采用由生物惰性荧光染料calcein green示踪和一氧化氮（NO）特异性探针标记,激光共聚焦显微镜实时检测的方法对半通道开放状态及这两种模型条件下细胞内NO进行了检测。结果显示OGD和MI两种脑缺血细胞模型均可导致大鼠海马神经元pannexinl半通道通透性和NO生成量的增加。过量生成的NO和pannexinl半通道通透性增加之间是否存在联系?为了进一步探讨NO是否参与pannexinl半通道的调控,本研究还分别对NO供体和一氧化氮合酶（NOS）抑制剂处理后的pannexinl半通道通透性进行了检测。发现NO供体可以导致pannexinl半通道通透性增加,而使用NOS抑制剂抑制NO的产生可降低pannexinl半通道的通透性。以上结果表明,脑缺血时过量生成的NO可能参与了半通道开放状态的调控。目前已有大量文献报道NO可以参与调控细胞膜上多种离子通道,但NO是否参与、如何参与半通道调控的研究少见报道。在上述研究基础上,针对NO相关信号通路的研究发现在NO对pannexinl半通道的调控过程中非NO-cGMP依赖的亚硝基化反应起了主要作用,而传统的NO-cGMP信号通路对pannexinl的调控并不起主要作用。这与目前对NO作用途径的认识相一致,即在生理条件下NO的作用主要由NO-cGMP信号通路介导,而在病理损伤条件下过量生成的NO主要通过亚硝基化损伤及氧化损伤的方式而起作用。半通道通透性增加既可由其开放概率增加引起也可由膜上半通道数量增加所致。所以,本研究通过应用免疫荧光标记技术、激光共聚焦显微镜成像技术、膜蛋白分离技术和蛋白印记技术对OGD处理1小时后pannexinl蛋白的分布进行了研究。结果显示在OGD处理海马神经元1小时后pannexinl蛋白在细胞内的分布没有改变,细胞膜上pannexinl蛋白量也没有增加。这提示在前述实验中pannexinl半通道通透性的增加主要是因半通道开放概率增加所致。最后,通过对OGD、OGD/再灌注、MI、局部脑缺血及局部脑缺血/再灌注模型中海马神经元pannexinl mRNA表达量进行检测发现pannexinl mRNA表达在OGD、OGD/再灌注及局部脑缺血/再灌注模型中均有上调,这提示pannexinl可能在急性脑缺血及缺血/再灌注的病理损伤过程中起作用。综上所述,本研究的主要结论及创新点如下:①、在急性脑缺血时海马锥体神经元细胞膜通透性增加主要是因为细胞膜上半通道开放概率增加所致;②、脑缺血时过量生成的NO参与调控pannexinl半通道的开放,具体调节是通过非NO-cGMP信号转导通路的方式进行,亚硝基化反应或其它氧化反应在调节中起了主要作用;③、海马锥体神经元pannexinl半通道在脑缺血模型中开放概率增加,OGD、OGD/再灌注和MCAO/再灌注模型均可导致pannexinl mRNA表达上调,这些结果提示由pannexinl蛋白构成的半通道及缝隙连接在急性脑缺血和脑缺血再灌注损伤过程中可能起了重要作用。以上研究结果为脑缺血疾病的防治提供新的基础资料,并为相关药物研发提供新的靶点与思路。