论文摘要
目的：良恶性嗜铬细胞瘤（PHEO）和副神经节瘤（PGL）的鉴别以及恶性嗜铬细胞瘤的有效治疗是目前神经内分泌肿瘤研究中尚未解决的难题。表观遗传学是目前研究肿瘤及疾病发生中除遗传学改变外的另一个重要领域。对嗜铬细胞瘤的表观遗传学研究国外才刚刚开始,故本研究选择与细胞周期调控有关的基因p16INK4a,DNA修复相关的基因]（?）MLH1、MGMT、BRCA1, ras相关信号传导途径的RASSFIA基因,细胞凋亡相关的DcR2基因,基因突变导致嗜铬细胞瘤发生的SDHB、SDHD、VHL基因以及本课题组前期研究中显示在嗜铬细胞瘤中低表达的LRP1B基因用表观遗传学中的甲基化特异性PCR方法（MSP）研究上述基因的甲基化状态,寻找嗜铬细胞瘤CpG岛甲基化表型；分析基因甲基化改变与患者肿瘤良恶性及其他临床特征之间的关系。方法：1.用E.Z.N.ATM DNA/RNA Isolation Kit提取24例PHEO（10例恶性,14例良性）、29例PGL（14例恶性,15例良性）和7例正常肾上腺髓质的组织DNA；2.甲基化特异性PCR方法检测不同组织中p16INK4a、RASSFIA、DcR2、MGMT、SDHB、SDHD、VHL、LRP1B、BRCA1、hMLH1基因的甲基化状态,探讨PHEO和PGL中上述基因DNA甲基化改变；3.分析患者基因启动子区甲基化状态与肿瘤良恶性及其他临床资料的关系,了解其在PHEO和PGL中的病理生理意义。结果：1. p16INK4a、RASSF1A、MGMT、DcR2基因在PHEO和PGL中的甲基化改变1)在53例PHEO/PGL组织中分别检测到p16INK4a、RASSFIA、MGMT、DcR24个基因的甲基化,检出率为52.8%、52.8%、35.8%、60.4%。在PHEO中4个基因甲基化检出率分别为58.3%（14/24）、58.3%（14/24）、41.7%（10/24）、54.2%（13/24）,其中恶性分别为33.3%（8/24）、25.0%（6/24）、20.8%（5/24）、20.8%（5/24）；在PGL中4个基因甲基化检出率分别为48.3%（14/29）、48.3%（14/29）、31.0%（9/29）、65.6%（19/29）,恶性分别为37.9%（11/29）、34.5%（10/29）、20.7%（6/29）和48.3%（14/29）;2) p16INK4a基因在良恶性PHEO、良恶性PGL中的甲基化检出率分别为42.9%（6/14）、80.0%（8/10）、20.0%（3/15）及78.6%（11/14）；3) RASSFIA基因在良恶性PHEO、良恶性PGL中的甲基化检出率分别为57.1%（8/14）、60.0%（6/10）、26.7%（4/15）及71.4%（10/14）；4) MGMT基因在良恶性PHEO、良恶性PGL中的甲基化检出率分别为35.7%（5/14）、50.0%（5/10）、20.0%（3/15）及42.9%（6/14）；5)DcR2基因在良恶性PHEO、良恶性PGL中的甲基化检出率分别为57.14%（8/14）、50.00%（5/10）、33.33%（5/15）及100%（14/14）；6)恶性PHEO和PGL中至少有一个基因发生甲基化,而在良性肿瘤中有8例标本（1例PHEO,7例PGL）4个基因均未发生甲基化。CpG岛甲基化表型（CIMP）阳性者19例,包括5例恶性PHEO、4例良性PHEO; 9例恶性PGL,1例良性PGL。2. p16INK4a、RASSFIA、MGMT、DcR2基因甲基化的临床意义1)恶性PGL患者24h尿去甲肾上腺素（NE）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）水平高于良性患者,差异有统计学意义（p<0.05）2) PHEO中p16INK4a基因甲基化的患者24h尿肾上腺素（E）高于非甲基化者,差异有统计学意义（p=0.014）。3)PGL中,p161NK4a基因甲基化多见于恶性患者（vs良性）,差异具有显著的统计学意义（p=0.002）,有多见于发病年龄小的趋势,但差异无统计学意义（p=0.085）。RASSFIA基因甲基化多见于恶性患者（vs良性）,差异具有显著的统计学意义（p=0.016）。DcR2基因甲基化多见于恶性患者、发病年龄小的患者,差异具有显著的统计学意义（p<0.01）。4)甲基化指数（MI）在恶性PGL患者明显高于良性患者,具有显著的统计学差异（p<0.001）。CpG岛甲基化表型（CIMP）阳性亦多见于恶性PGL患者,与良性患者相比差异具有显著的统计学意义（p=0.002）。3. p16INKa、RASSFIA、MGMT、DcR2基因甲基化的相关性分析1) PHEO中RASSFIA与DcR2基因甲基化具有相关性（r=0.410,p<0.05）。2)PGL中p16INK4a与DcR2基因甲基化具有相关性（r=0.556,p<0.01）；RASSFIA与MGMT、DcR2基因甲基化具有相关性（r=0.396,p<0.05和r=0.411,p<0.05）。4. SDHB、SDHD、VHL、LRP1B、BRCA1、hMLHl基因在PHEO和PGL中的甲基化改变未检测到该6个基因DNA甲基化改变。结论：1.84.9%（45/53）的PHEO和PGL中至少有p16INK4a、RASSFIA、DcR2、MGMT四个基因中的1个以上发生启动子区甲基化,提示上述肿瘤抑制基因DNA甲基化在PHEO和PGL的发生发展中起重要作用；2. p16INK4a、RASSFIA、DcR2基因甲基化均与PGL的恶性行为有关,提示p16INK4a、RASSFIA、DcR2基因启动子区的甲基化状态可作为鉴别良恶性PGL的实验室依据,对甲基化阳性的患者应进行密切随访观察。3.甲基化指数（MI）及CpG岛甲基化表型（CIMP）均与PGL的恶性程度有关,提示恶性PGL中有多个肿瘤抑制基因高甲基化水平,检测多个基因启动子区的甲基化状态对于鉴别PGL的良恶性具有一定的指导意义。目的：为比较同一患者肿瘤组织与血浆中DNA甲基化的异同,本实验对第一部分中的部分患者进行血浆中p16INK4a、RASSF1A基因DNA甲基化研究,并分析其与相应肿瘤组织中基因甲基化的相关性,为临床检测提供依据。方法：1.用Qiagen DNA blood mini kit提取恶性副神经节瘤（n=8）、良性副神经节瘤（n=6）、恶性嗜铬细胞瘤（n=7）、良性嗜铬细胞瘤（n=8）患者血浆DNA；2.半巢式甲基化特异性PCR方法检测血浆p16INK4a、RASSF1A基因的甲基化状态；比较血浆基因启动子区甲基化与组织中基因甲基化状态及与患者临床特征之间的关系。结果：1.29例患者血浆及相应肿瘤组织p16INK4a基因甲基化检出率分别为44.83%（13/29）和55.17%（16/29）,血浆和肿瘤组织甲基化检出率差异无统计学意义；p16INK4a基因启动子区甲基化在PHEO/PGL的血浆和肿瘤组织中显著正相关（r=0.813,p<0.001）；2.29例患者血浆及相应肿瘤组织RASSF1A基因甲基化检出率分别为31.03%（9/29）和44.83%（13/29）,血浆和肿瘤组织甲基化检出率差异无统计学意义；RASSF1A基因启动子区甲基化在PHEO/PGL的血浆和肿瘤组织中显著正相关（r=0.694,p<0.001）；3. p16INK4a基因的甲基化在性别、发病年龄、遗传性、肿瘤部位、数目、大小、Ki-67%等之间均无统计学差异（p>0.05）。p16INK4a基因的甲基化多见于恶性患者,差异具有显著的统计学意义（p<0.05）；4.血浆RASSF1A基因启动子区甲基化与性别、年龄、肿瘤性质、肿瘤数目、大小、24h尿儿茶酚胺水平、Ki-67%等无明显相关（p均>0.05）。结论：应用半巢式MSP技术检测的血浆p16INK4a和RASSFIA基因DNA甲基化状态,与相应肿瘤组织中的甲基化状态相关；可提供临床早期检测鉴别肿瘤良恶性。目的：研究第一、二部分检测了PHEO和PGL肿瘤组织和血浆中p16INK4a、RASSFIA基因甲基化的改变,故本研究拟观察p16INK4a、RASSFIA mRNA在嗜铬细胞瘤和副神经节瘤以及正常肾上腺髓质中的表达,探讨其与患者临床特征及基因甲基化的关系,了解其在PHEO和PGL中的作用。方法：1.用E.Z.N.ATM DNA/RNA Isolation Kit提取24例PHEO（10例恶性,14例良性）、29例PGL（14例恶性,15例良性）和7例正常肾上腺髓质的组织DNA；2.实时荧光定量PCR方法检测上述不同组织中p16INK4a、RASSFIA基因和内参照β-actin mRNA的表达；3.分析p16INK4a、RASSFIA mRNA表达与PHEO和PGL患者的临床特征及基因启动子区甲基化的关系。结果：1. p16INK4a mRNA在PHEO和PGL中的表达1) p16INK4a mRNA在良恶性PHEO和良恶性PGL中的表达均明显低于正常肾上腺髓质,差异有显著的统计学意义（p均<0.01）；2)良恶性PHEO、良恶性PGL四组之间p16INK4a mRNA表达差异无统计学意义（vs恶性PGL,p=0.088,0.213,0.367）2. RASSFIA mRNA在PHEO和PGL中的表达1) RASSF1A mRNA在良恶性PHEO和良恶性PGL中的表达均明显低于正常肾上腺髓质,差异有显著的统计学意义（p均<0.05）；2)良恶性PHEO、良恶性PGL四组之间RASSFIA mRNA表达差异无统计学意义（vs恶性PGL,p=0.314,0.732,0.876）3. p16INK4a和RASSF1A mRNA表达与PHEO和PGL患者临床特征的关系1) PHEO和PGL中mRNA表达在不同性别、年龄、肿瘤部位、数目、大小、Ki-67阳性率等临床特征之间未见统计学差异（p均>0.05）。2)PHEO和PGL中RASSF1A mRNA表达在患者不同临床特征之间亦未见统计学差异（p均>0.05）。4.p16INK4a和RASSF1A mRNA表达与基因启动子区甲基化的关系1)p16INK4a mRNA表达在检测出p161NK4a基因甲基化与非检测出甲基化的PHEO/PGL之间差异无统计学意义（p均>0.05）。p16INK4a mRNA表达水平与基因甲基化状态未见明显相关性（p>0.05）。2) RASSF1A mRNA表达在检测出RASSF1A基因甲基化与非检测出甲基化的PHEO/PGL之间差异无统计学意义（p均>0.05）。RASSF1A mRNA表达水平与基因甲基化状态未见明显相关性（p>0.05）。结论：p16INK4a和]RASSF1A基因mRNA在PHEO和PGL中表达降低,而p16INK4a. RASSF1A mRNA表达在基因甲基化和非甲基化患者差异无统计学意义,提示基因启动子区甲基化是p16INK4a和]RASSF1A基因失活的主要机制之一,同时可能有其他机制参与基因失活,如杂合缺失、其他表观遗传学异常（组蛋白乙酰化、miRNA干扰）等。
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