论文摘要
第一部分siRNA干扰TM4细胞uPA表达的研究目的：采用化学合成的小干扰RNA （siRNA）转染小鼠睾丸支持细胞株TM4细胞,观察uPA表达的变化,筛选uPA-siRNA的有效干扰序列,为后续构建慢病毒介导的受Tet调控的uPA干扰载体提供实验依据。方法：在验证TM4细胞有内源性uPA表达的基础上,针对小鼠uPA mRNA靶序列设计三段不同的siRNA序列（si-uPA1,si-uPA2, si-uPA3）,通过荧光标记的siRNA （Cy3-siRNA）确定有效转染浓度后,在阳离子脂质体Lipofectamine2000介导下分别将三段si-uPA序列瞬时转染TM4细胞,设立空白对照组（未转染）、试剂对照组（加入Lipofectamine2000）和阴性对照组（转染阴性siRNA, siRNA-scramble）。采用实时荧光定量PCR技术（qRT-PCR）和Western-Blot技术检测转染后各组细胞uPA mRNA和uPA蛋白的表达情况,分析比较uPA表达的变化,确定si-uPA的有效干扰序列。针对该序列,设定不同浓度（30 nM、50 nM和100 nM）的siRNA转染TM4细胞,分别作用24 h、48 h和72 h后,qRT-PCR测定uPA mRNA改变,观察siRNA对TM4细胞uPA表达的影响。结果：TM4细胞中有内源性uPA表达。20 nM的Cy3-siRNA转染TM4细胞后仅见微弱的Cy3红色荧光,随着转染浓度的增加,荧光浓度逐渐增强,表达红色荧光的TM4细胞增多,以50 nM和100 nM最为明显,选定50 nM作为siRNA的有效转染浓度。三种si-uPA转染TM4细胞后,uPA表达量均较空白对照组明显下降（P<0.05）,以si-uPA1作用最为明显,而试剂对照组uPA mRNA表达无明显改变。用si-uPAl转染TM4细胞进行时效量效实验,结果显示,转染24 h后,转染组细胞uPA mRNA的表达均较对照组显著降低,其中100 nM组抑制效果最为明显,抑制率达到70%,抑制效果强于30 nM组和50 nM组（P<0.05）；随转染时间的延长,uPA mRNA表达持续降低,转染72 h后,三组细胞uPA mRNA表达量分别为对照组的53.9%、35.3%和27.7%,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论：本部分成功筛选出针对uPA mRNA靶序列的有效干扰序列si-uPA1,转染TM4细胞后,在24 h即可抑制细胞uPA mRNA的表达,抑制效应持续至72 h；同一浓度的si-uPA1在不同时间点内的抑制效应无显著性差异；同一时间点内,抑制效应随转染浓度的增加而增强,表现出良好的量效关系。第二部分慢病毒介导的可诱导RNAi体系的建立目的：在第一部分实验基础上构建慢病毒介导的含有Tet调控元件的uPA干扰载体,进行病毒包装和滴度测定后,感染TM4细胞,利用抗性筛选获得TM4双稳转细胞株,为后续Dox调控提供前提条件。方法：根据第一部分实验获得的uPA-siRNA的有效干扰序列si-uPA1,设计合成uPA-shRNA oligo,退火成双链,插入入门载体pENTR/H1/TO中,转化感受态细胞,获取入门克隆。利用Gateway技术的LR重组反应,将入门克隆中的Hl/TO-RNA干扰序列转入慢病毒表达载体pLenti4-BLOCK-iT-DEST中,转化感受态细胞,提取质粒,测序验证,构建针对uPA的慢病毒干扰载体pLenti4-sh。将慢病毒表达载体pLenti4-sh和含有四环素抑制子（tetracycline repressor, TetR）的慢病毒载体pLenti6/TR分别转染293T细胞,包装病毒,收集病毒原液,超速离心浓缩,运用qRT-PCR技术测定病毒滴度。用不同浓度的抗生素以及带EGFP的慢病毒原液（Lentil-EGFP）感染TM4细胞,选择抗生素的最佳筛选浓度和病毒感染的感染复数（multiplicity of infection, MOI）值。在此基础上,将pLenti6/TR慢病毒液感染TM4细胞,用Blasticidin筛选阳性细胞,qRT-PCR检测TetR的表达,建立TetR稳转细胞株TM4-Lenti6/TR;将pLenti4-sh慢病毒液感染TM4-Lenti6/TR,用Blasticidin和Zeocin共同筛选阳性细胞,qRT-PCR检测TetR和抗性基因的表达,建立双稳转细胞株TM4-Lenti6/TR & Lenti4-sh.结果：针对uPA靶序列构建的慢病毒干扰载体为pLenti4-sh,经测序验证,序列比对完全正确。慢病毒包装后,qRT-PCR测定Lenti6/TR病毒的物理滴度为9.8×109vp/ ml, Lenti4-sh病毒的物理滴度为1.72×1010vp/ml。不同浓度抗生素作用TM4细胞后,根据细胞生长状况观察,选择Blasticidin最佳筛选浓度为1μg/ml, Zeocin的最佳筛选浓度为600μg/ml.随着感染TM4细胞的Lentil-EGFP MOI值的增大,表达EGFP的TM4细胞增多,荧光亮度增强。因而将慢病毒感染TM4细胞的MOI设立为100。根据2-ΔΔCt的方法相对定量,TM4-Lenti6/TR细胞中TetR基因的表达量为正常TM4细胞的27301.01倍,而TM4-Lenti6/TR & Lenti4-sh细胞中TetR基因和抗性基因表达量分别正常TM4细胞的406623.29倍和51212760.84倍。结论：成功构建了慢病毒介导的含有Tet调控元件的uPA干扰载体。经TM4细胞感染和抗性筛选后,建立了TetR稳转细胞株TM4-Lenti6/TR和双稳转细胞株TM4-Lenti6/TR & Lenti4-sh.第三部分可诱导的RNAi调控uPA表达的实验研究目的：利用第二部分实验中获得的稳转细胞株和携带uPA干扰载体的慢病毒液,构建体外细胞培养体系和小鼠在体动物模型,通过Dox给药,观察双稳转细胞株和小鼠睾丸组织uPA mRNA和蛋白表达情况以及uPA酶活性的改变,评估Dox对uPA的诱导效应。方法：通过MTT实验检测不同浓度Dox对TM4细胞的毒性,筛选Dox作用安全剂量。在此基础上,将第二部分获得的双稳转细胞株TM4-Lenti6/TR& Lenti4-sh进行体外培养,以TetR稳转细胞株TM4-Lenti6/TR和TM4细胞作为对照,通过Dox诱导,在24 h、48 h、72 h观察各组细胞uPA mRNA和蛋白表达的抑制情况以及细胞培养液中uPA酶活性的改变,评估Dox的体外诱导效应。在Dox作用72 h后,移除Dox,观察移除24 h、48 h、72 h后uPA mRNA和蛋白表达的恢复情况。将慢病毒液Lenti4-sh和Lenti6/TR经皮睾丸注射,构建小鼠实验模型,以注射Lenti6/TR慢病毒液和生理盐水的小鼠作为对照,通过Dox灌胃进行体内诱导,在Dox作用24 h、48 h、72 h和1周后观察各组小鼠睾丸组织uPA mRNA和蛋白的表达情况以及睾丸组织匀浆液uPA酶活性变化。结果：MTT实验筛选得出Dox作用于TM4细胞的安全浓度在5μg/ml以下。以1μg/ml的Dox对TM4-TetR&shuPA、TM4-TetR和TM4细胞进行体外诱导,结果显示,后两组细胞uPA表达在诱导组和非诱导组间无明显差异,而TM4-TetR&shuPA双稳转细胞组的uPA mRNA在Dox诱导24 h后即较非诱导组有明显下降,随诱导时间的延长,抑制作用更为明显,作用72 h时,诱导组表达量仅为非诱导组的35%。uPA蛋白表达变化较mRNA出现略晚,在Dox诱导72 h后,蛋白表达较非诱导组显著降低。S-2251发色底物法检测结果示,双稳转细胞诱导组uPA酶活性在72 h时明显降低,为非诱导组的65.1%。随着Dox从细胞培养液的移除,uPA表达逐渐恢复,移除48 h后,uPAmRNA和蛋白表达水平与非诱导组无显著性差异。雄性小鼠经皮睾丸内注射慢病毒载体后,以0.75 mg/ml的Dox进行诱导,结果表明,TetR&shuPA小鼠在Dox作用24 h后,uPA mRNA水平较非诱导组以及对照组明显降低,随Dox作用时间的延长,uPA mRNA的表达逐渐减少,Dox作用1周后,抑制作用最为明显,uPA mRNA表达水平与诱导24 h比较差异具有统计学意义。uPA蛋白与mRNA表达情况略有不同,在Dox作用的72 h内,TetR&shuPA小鼠睾丸uPA蛋白与非诱导组表达水平相接近,而在Dox作用1周后,uPA蛋白表达水平在诱导组出现了明显下降,与非诱导组有显著差异。结论：Dox对细胞培养体系和小鼠睾丸组织内的uPA表达均有调控作用,其抑制uPA表达在体外体系可维持至72 h,移除Dox后,uPA表达水平在48 h内逐渐恢复。小鼠在体模型中,Dox诱导可以下调睾丸组织中uPA表达水平以及匀浆液uPA酶活性,抑制作用至诱导1周最为明显。第四部分调控uPA表达影响雄性小鼠生育力的实验研究目的：通过第三部分动物体内诱导实验,观察睾丸uPA表达受到可诱导的RNAi调控后,雄性小鼠生育力、精子功能的改变,分析uPA影响雄性小鼠生育力的可能机制。方法：慢病毒液经皮睾丸注射构建雄性小鼠动物模型,Dox灌胃1周后行交配实验,观察雄鼠交配率、交配雌鼠妊娠率、平均胚胎数和黄体数。解剖雄鼠,测定附睾精子活动百分率和存活率,低渗肿胀实验观察精子膜功能。小鼠睾丸附睾取材,光镜和透射电镜观察组织病理和超微结构改变,并观察动物生殖系统外其他组织器官病理变化。分别在Dox停药2周、4周和8周再次与雌鼠交配,观察雄鼠生育力和精子功能的恢复情况。结果：Dox给药1周后各组小鼠交配率无明显差异。TetR&shuPA小鼠诱导组雌鼠妊娠率和平均胎数较非诱导组和空白对照组显著降低,差异具有统计学意义（P<0.05）,平均黄体数无显著性差异。停药2周后,TetR&shuPA诱导组雌鼠妊娠率和平均胎数明显增加,至停药8周时,雌鼠妊娠率和平均胎数与非诱导组和空白对照组水平相当。Dox诱导后,各组小鼠的精子存活率和精子低渗肿胀率均无明显差异。TetR&shuPA小鼠活动精子百分率较非诱导组和空白对照组明显下降（P<0.05）。随Dox停药时间的延长,TetR&shuPA诱导组小鼠精子活力逐渐恢复,至停药8周时,诱导组小鼠精子活力恢复至空白对照组水平。Dox用药后,各组小鼠睾丸附睾组织结构和超微结构未见明显病理改变。实验组小鼠其他组织器官未见病理性结构损伤。结论：Dox体内诱导睾丸uPA表达下调后不影响雄鼠的交配率及雌鼠黄体数,交配雌鼠的妊娠率和平均胎仔数下降。uPA的下调不影响精子存活率和精子膜功能,但可导致雄鼠精子活力降低。雄鼠生育力和精子活力在Dox停药8周后可完全恢复。uPA下调对雄鼠睾丸、附睾病理结构和超微结构无明显病理影响,雄鼠的心、肝、脾、肺、肾等主要脏器形态未见明显损伤性改变。