冬小麦麸皮抗冻蛋白结构及其抗冻机理的研究

论文摘要

抗冻蛋白（AFP,antifreeze protein）是一种可以非依数性降低冰点、抑制体系发生重结晶特性的蛋白质,广泛地分布在鱼类、动物、昆虫、植物以及微生物中,是生命体抵御外界寒冷环境应激性反应所产生的一种蛋白。据报道,AFP具有提高产品质量,提高农作物抗寒能力,提高冷冻体细胞存活率等作用,广泛地应用于食品、生物、临床医学和化工等领域。本文以谷物原料进行筛选,发现冬小麦麸皮中存在AFP,并进一步对冬小麦麸皮抗冻蛋白（TaAFP）进行分离纯化,研究其理化特性、一级结构和二级结构,并以一级结构为基础,探讨TaAFP与冰晶的结合方式,揭示其抗冻机理。论文首先研究了AFP的检测方法。文中比较了目前常用AFP的检测方法,发现差热分析仪法（DSC）具有样品用量小、可以精确控制温度、可以获得准确结果等优点,因此确定DSC法为本文AFP抗冻活性（THA）的检测方法。还进一步研究了影响测定结果的各个因素,考察使用DSC法测定THA的稳定性、重复性和精密度,结果显示DSC法测定样品THA具有较高的稳定性、重复性和精密度,其RSD在0.4 %以下,相对标准偏差为3.84 %。具体的测定程序如下:样品溶解于10 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 8.0）达到最终蛋白浓度1.0 mg/mL,将10μL样品在坩埚中平衡15min后,按照1.0oC/min的速度进行升降温,在保留温度Th时,保持体系的冰晶质量含量占体系的10 % - 90 %（质量分数）。从多种谷物中筛选AFP,并对其进行分离纯化。筛选结果发现在冬小麦麸皮中存在AFP,进一步分别采用传统的分离法、特异性亲和法和条带切割法对冬小麦麸皮抗冻蛋白（TaAFP）纯化,均获得电泳纯的样品。比较三种纯化方法的优缺点:传统的分离纯化方法在AFP或其它活性物质的筛选中具有普遍适用性;特异性亲和分离纯化法将来可能会适用于AFP大规模的粗分离;电泳条带切割法适用于高精度和高纯度样品的纯化和分析。研究了TaAFP的物理与化学性质,结果发现TaAFP中无糖基。氨基酸分析结果推测TaAFP由155个氨基酸残基组成,相对分子质量13085.2。其中,Glycine残基占52.26%（摩尔百分含量）,属于富甘氨酸蛋白（GRP）。使用ExPASy数据库检索与TaAFP相关的GRP发现,TaAFP是一种与冷诱导或其它诱导相关的蛋白。TaAFP的变性温度为61.47oC,变性后,THA丧失,属于热不稳定型AFP。TaAFP在微碱性的环境中（pH 7.0-9.0）显示较高的THA,该环境恰好与植物的生理状态环境一致。TaAFP属于Ca2+-dependend AFP,在Ca2+存在的情况下,THA得到增强。TaAFP还具有AFP所应有的亲水性和较高的分配系数（质量分数大于90%）。MALDI-TOF-MS分析结果显示TaAFP的相对分子质量为13637.711,与上述SDS-PAGE和氨基酸分析推测获得的结果基本吻合。进一步采用了结合N-末端测定和肽指纹图谱的分析方法测定TaAFP的一级结构,结果表明其一级结构为:MARKVIALAFLLLLTISLSKSNAAR VKYNGGESGGGGGGGGGGGGGGNGSGSGSGYGYNYGKGGGQSGGGQGGGGGGGGGGGSNGSGSGSGYGYGYGQGNGGAQGQGSGGGGGGGGGGGGGGSGQGSGSGYGYGYGKGGGGGGGGGGDGGGGGGGGSAYVGRHE,测定覆盖度达到100 %。TaAFP的二级结构分别采用圆二色性光谱、拉曼光谱、红外光谱以及生物信息学的预测方法测定。TaAFP中α-helix的含量为10%-15%;β-sheet的含量为10%-20%,random coil的含量为40%-60%。采用分子力学和量子力学的方法研究了TaAFP和（1121）冰晶面的结合情况。计算结果显示蛋白面M1（Met1、Lys4、Gly47、Asn48、Ser50、Gly51、Gly138、Gly139、Gly141、Gly142、Gly143、Gly161、Arg162、His163和Glu164）与冰晶面具有最强的结合能力。其中,静电作用和范德华作用大大超过了氢键的作用。另一方面,运用半经验量子力学的方法AM1和PM3进一步获得了TaAFP与冰晶面的微观相互作用。首先,当TaAFP与冰晶面作用时,蛋白面M1和冰晶之间发生弱轨道相互作用,AM1和PM3的计算结果均显示面M1与冰晶面之间的弱轨道相互作用是最强的。第二,半经验量子力学计算证实TaAFP与冰晶面之间存在电荷迁移,对整个体系而言,电子是从TaAFP迁移到冰晶上。因此,TaAFP与冰晶相互作用增强。第三,键级能的计算结果显示各个蛋白面与冰晶面的键级能基本上相当,其中,M1属于相互作用较强的面。因此,确定蛋白面M1是TaAFP与冰晶的最佳结合面。TaAFP的抗冻机理就在于M1通过库仑作用、范德华作用、轨道重合和电荷迁移等相互作用与冰晶面紧密的结合。当M1与冰晶面结合后TaAFP锚定于冰晶表面,冰晶如果继续生长,则冰晶的表面积需要增加,而冰晶表面积的增加则需要外界进一步提供能量。提供能量后,系统的熵降低,体系温度下降。在宏观上则表现为冰晶需要更低的温度才可以进一步生长,体系的冰点被降低,即产生热滞现象。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 抗冻蛋白的分类及其特点
• 1.1.1 抗冻蛋白的分类
• 1.1.2 抗冻蛋白的特性
• 1.1.2.1 抗冻蛋白非依数性降低冰点的活性
• 1.1.2.2 抗冻蛋白修饰冰晶形态的活性
• 1.1.2.3 抗冻蛋白抑制冰晶发生重结晶的活性
• 1.2 抗冻蛋白热滞活性的检测方法
• 1.2.1 毛细管单晶生长法
• 1.2.2 差示扫描量热法
• 1.2.3 微量渗透压计法
• 1.2.4 其它方法
• 1.3 抗冻蛋白的分离纯化
• 1.3.1 血清中抗冻蛋白的分离纯化
• 1.3.2 动物组织中抗冻蛋白的分离纯化
• 1.3.3 植物中抗冻蛋白的分离纯化
• 1.3.4 抗冻蛋白的亲和分离纯化
• 1.4 抗冻蛋白的结构研究
• 1.4.1 鱼类抗冻蛋白
• 1.4.2 植物抗冻蛋白
• 1.4.3 昆虫抗冻蛋白
• 1.5 抗冻蛋白的抗冻机理研究
• 1.5.1 吸附－抑制模型
• 1.5.2 晶格匹配模型
• 1.5.3 偶极子－偶极子模型
• 1.5.4 晶格占有模型
• 1.5.5 氢原子结合模型
• 1.5.6 刚体能量模型
• 1.5.7 表面互补模型
• 1.6 分子模拟研究抗冻蛋白抗冻机理
• 1.6.1 分子模拟的基本方法
• 1.6.2 分子模拟在抗冻蛋白研究中的应用
• 1.7 抗冻蛋白的应用研究
• 1.7.1 抗冻蛋白在食品工业中的应用
• 1.7.2 抗冻蛋白在器官保藏中的应用
• 1.7.3 抗冻蛋白在基因工程改善植物抗冻性的应用
• 1.7.4 抗冻蛋白在其它行业中的应用
• 1.8 课题的研究意义以及研究内容
• 1.8.1 课题的研究意义
• 1.8.2 课题的研究内容
• 1.9 参考文献
• 第二章 抗冻蛋白抗冻活性检测方法的研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验设备
• 2.1.3 实验方法
• 2.1.3.1 红萝卜抗冻蛋白的制备
• 2.1.3.2 SDS-PAGE
• 2.1.3.3 RP-HPLC 测定样品的纯度
• 2.1.3.4 DSC 法测定样品THA
• 2.1.3.5 DSC 法测定样品THA 的稳定性、专一性和精密度的评价
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 DcAFP 的分离纯化
• 2.2.2 升降温速率对THA 的影响
• 2.2.3 原料浓度对THA 的影响
• 2.2.4 冰晶含量对THA 的影响
• 2.2.5 DSC法检测THA 稳定性的研究
• 2.2.6 DSC法检测THA 重复性的研究
• 2.2.7 DSC法检测THA 精密度的研究
• 2.3 结论
• 2.4 参考文献
• 第三章 冬小麦麸皮抗冻蛋白分离纯化的研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验设备
• 3.1.3 实验方法
• 3.1.3.1 电泳
• 3.1.3.2 样品基本成分的测定方法
• 3.1.3.3 RP-HPLC测定样品的纯度
• 3.1.3.4 特异亲和法分离纯化抗冻蛋白
• 3.1.3.5 抗冻蛋白的筛选
• 3.1.3.6 DSC 法测定样品THA
• 3.1.3.7 TaAFP 的传统分离方法
• 3.1.3.8 TaAFP 的特异性亲和分离方法
• 3.1.3.9 TaAFP 的条带切割分离方法
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 抗冻蛋白的筛选结果
• 3.2.2 冬小麦麸皮的基本成分
• 3.2.3 TaAFP 的传统分离方法
• 3.2.4 TaAFP 的特异性亲和分离方法
• 3.2.5 TaAFP 的条带切割分离方法
• 3.2.6 三种分离方法获得的TaAFP 的比较
• 3.3 结论
• 3.4 参考文献
• 第四章 冬小麦麸皮抗冻蛋白性质的研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 实验设备
• 4.1.3 实验方法
• 4.1.3.1 THA 的测定
• 4.1.3.2 TaAFP 氨基酸组成分析
• 4.1.3.3 TaAFP 热变性温度的测定
• 4.1.3.4 溶液pH 值和阳离子种类对样品THA 的影响
• 4.1.3.5 TaAFP 亲水性的测定
• 4.1.3.6 TaAFP 表面疏水性的测定
• 4.1.3.7 电泳
• 4.1.3.8 使用金手指特异亲和法测定TaAFP 的分配系数
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 TaAFP的电泳分析结果
• 4.2.2 TaAFP的氨基酸组成
• 4.2.3 TaAFP 的变性温度以及其THA 的变化
• 4.2.4 pH 值和阳离子对TaAFP 的THA 活性的影响
• 4.2.5 TaAFP的亲水能力
• 4.2.6 TaAFP的疏水能力
• 4.2.7 TaAFP在冰晶相和液相的分配系数
• 4.3 结论
• 4.4 参考文献
• 第五章 冬小麦麸皮抗冻蛋白结构的研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 实验材料与设备
• 5.1.2 实验方法
• 5.1.2.1 MALDI-TOF-MS测定蛋白的分子量
• 5.1.2.2 N-末端的测定
• 5.1.2.3 TaAFP 酶切的方法
• 5.1.2.4 肽指纹图谱的检测
• 5.1.2.5 紫外波长检测
• 5.1.2.6 Raman 光谱检测
• 5.1.2.7 FT-IR 光谱检测
• 5.1.2.8 圆二色性光谱检测
• 5.1.2.9 二级结构的预测
• 5.2 结果与讨论
• 5.2.1 TaAFP 相对分子质量的确定
• 5.2.2 TaAFP 序列的分析和确定
• 5.2.3 TaAFP 同源性分析结果
• 5.2.4 TaAFP 紫外光谱检测结果
• 5.2.5 TaAFP 圆二色性光谱检测结果
• 5.2.6 TaAFP Raman 光谱检测结果
• 5.2.7 TaAFP FT-IR 光谱检测结果
• 5.2.8 使用生物信息学方法预测 TaAFP 二级结构的结果
• 5.2.9 TaAFP 二级结构的总结
• 5.3 结论
• 5.4 参考文献
• 第六章 冬小麦麸皮抗冻蛋白抗冻机理的研究
• 6.1 实验方法
• 6.1.1 TaAFP 的同源建模
• 6.1.2 蛋白表面的选择和划分
• 6.1.3 冰面的构建
• 6.1.4 TaAFP-冰晶相互结合的模拟
• 6.1.5 分子力学理论计算最佳TaAFP-冰晶结合面
• 6.1.6 量子力学理论计算最佳TaAFP-冰晶结合面
• 6.2 结果与讨论
• 6.2.1 TaAFP 的建模结果
• 6.2.2 TaAFP 蛋白表面区域划分结果
• 6.2.3 分子力学方法计算TaAFP 与冰晶面之间的相互作用能
• 6.2.4 体系总能量对TaAFP 与冰晶面之间相互作用能的影响
• 6.2.5 分子轨道重叠对TaAFP 与冰晶面之间相互作用能的影响
• 6.2.6 电荷迁移作用对TaAFP 与冰晶面之间相互作用能的影响
• 6.2.7 键级能对TaAFP 与冰晶面之间相互作用能的影响
• 6.2.8 TaAFP 与冰面结合的模型
• 6.3 结论
• 6.4 参考文献
• 论文主要结论及主要创新点
• 攻读博士学位期间主要学术成果
• 致谢
• 附：灯