猪链球菌2型胞外因子基因片段的原核表达及免疫保护力试验

论文摘要

猪链球菌2型（Streptococcus suis type 2, SS2）是重要的人畜共患病原菌,胞外因子（extracelluar factor, EF）是其重要的毒力因子。本研究以SS2江苏98分离株HA9801的基因组DNA为模板,PCR扩增ef基因14232203序列。将扩增产物克隆到测序载体pMD 18-T,转化大肠杆菌JM109,蓝白斑筛选阳性克隆,再提取质粒,分别用酶切、PCR和测序鉴定,结果表明所扩增目的片段的大小和方向均正确。将重组质粒pMD 18-T/ef经限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ酶切消化后,亚克隆ef至表达质粒pGEX-4T-1中,经酶切、PCR扩增及序列分析鉴定,表明ef基因完整编码框正确插入到表达载体pGEX-4T-1中。将重组表达载体pGEX-4T-1/ef转化大肠杆菌DH5α,用终浓度为0.5mM的IPTG诱导表达,SDS-PAGE表明ef基因在大肠杆菌DH5α中高效表达,且表达蛋白主要以包涵体的形式存在于细胞质中。用DOC提取包涵体,Western-blot分析说明该片段上存在EF的抗原表位。用处理后的包涵体免疫BALB/c小鼠,再以同源菌HA9801 1.0×109CFU/mL菌数攻毒后,相对保护率达44.4%,表明EF是SS2的免疫保护性抗原。

论文目录

• 摘要
• Summary
• 前言
• 第一篇 文献综述
• 猪链球菌2 型的研究进展
• 1 猪链球菌2 型的发现
• 2 流行病学研究
• 3 猪链球菌2 型的毒力因子
• 3.1 荚膜多糖
• 3.2 溶菌酶释放蛋白和胞外因子
• 3.3 溶血素
• 3.4 毒力相关蛋白
• 4 毒力因子的复杂性
• 5 协同性致病因子
• 6 动物模型
• 7 致病机理
• 8 猪链球菌的鉴定
• 8.1 生化鉴定
• 8.2 血清学鉴定
• 8.3 分子鉴定
• 8.3.1 多酶电泳法
• 8.3.2 限制性内切酶图谱分析法
• 8.3.3 随即扩增核酸片段多态性分析（RAPD）
• 8.3.4 PCR 法
• 9 预防和治疗
• 参考文献
• 第二篇 研究报告
• 猪链球菌2 型胞外因子基因片段的原核表达及免疫保护力试验
• 1 材料与方法
• 1.1 菌种和质粒
• 1.2 细菌培养
• 1.3 兔552 阳性血清的制备
• 1.3.1 动物免疫
• 1.3.2 采血
• 1.3.3 分离血清
• 1.4 目的片段的选择
• 1.5 引物的设计和合成
• 1.6 重组克隆质粒构建
• 1.7 目的片段的获得
• 1.7.1 PCR 模板的制备
• 1.7.2 目的片段的PCR 扩增及电泳
• 1.7.3 PCR 扩增产物的回收
• 1.8 目的片段的A/T 克隆与鉴定
• 1.8.1 PCR 产物与载体pMD 18-T 的连接反应
• 1.8.2 感受态细胞的制备
• 1.8.3 连接产物的转化
• 1.8.4 重组克隆质粒的提取
• 1.8.5 重组克隆质粒的鉴定
• 1.9 重组表达质粒的构建与鉴定
• 1.9.1 目的片段与载体的酶切和回收
• 1.9.2 感受态细胞的制备
• 1.9.3 目的片段与载体的连接转化
• 1.9.4 重组表达质粒的鉴定
• 1.10 重组质粒在原核细胞中的表达及检测
• 1.10.1 最佳诱导条件筛选
• 1.10.2 表达蛋白的 SDS-PAGE
• 1.10.3 Western Blot 鉴定分析
• 1.10.4 GST-EF 包涵体蛋白的大量制备
• 1.11 表达蛋白的免疫保护力测定
• 1.11.1 试验动物及分组
• 1.11.2 免疫及攻毒试验
• 1.11.3 采血
• 1.11.4 分离血清
• 1.11.5 表达 EF 蛋白的抗体效价
• 2 结果
• 2.1 ef 基因片段 PCR 扩增
• 2.2 重组克隆质粒的鉴定
• 2.2.1 PCR 鉴定
• 2.2.2 酶切鉴定
• 2.2.3 序列分析
• 2.3 重组表达质粒鉴定
• 2.3.1 电泳鉴定
• 2.3.2 酶切、PCR 及测序鉴定
• 2.4 表达产物EF 蛋白在DH5α细胞中的表达情况检测
• 2.4.1 最佳诱导条件筛选
• 2.4.2 Western blot 分析
• 2.4.3 包涵体处理
• 2.5 免疫保护力试验
• 2.6 抗体效价
• 3 讨论
• 3.1 猪链球菌2 型ef 片段的原核表达
• 3.2 重组蛋白表达效率的影响因素
• 3.3 EF 的免疫保护力
• 参考文献
• 结论
• 致谢
• 附录
• 缩写词英汉对照表
• 计量单位
• 个人简介
• 导师简介