大肠杆菌表达CPC酰化酶基因的工程菌构建及催化研究

论文摘要

头孢菌素C酰化酶（CCA）是一步酶法生产7-氨基头孢烷酸（7-ACA）的关键酶,能够将原料头孢菌素C（CPC）直接催化生成7-ACA。本论文通过人工合成获得一段源自的P. diminuta N176的头孢菌素C酰化酶基因（cpca）,采用基因工程的手段,将cpca基因克隆并构建了相应的诱导型重组大肠杆菌,实现CPC酰化酶的活性表达。并研究了此酶的催化性质。人工合成的基因经过突变优化后,证明能够在BL21（DE3）plysS/ pET24Δ体系中表达具有很高底物特异性的CCA,对CPC转化率达90%以上。将基因克隆并构建相应的组成型重组大肠杆菌J-KTHPR-fcpca、T-KToriP-cpca菌株,发现cpca基因在两体系中均无法表达。构建了具有T7表达系统的重组质粒pET28-cpca、pET30-cpca,比较了二者在宿主JM109（DE3）中对于CPC酰化酶表达的差异。首先在BL21（DE3） plysS/pET30-cpca体系中成功的表达了CPC酰化酶基因。对质粒pET30-cpca的lacI基因进行敲除获得pET30Δ-cpca质粒,比较了二者对于CPC酰化酶表达的差异。得到最优条件,28℃、4h乳糖诱导终浓度1.0%,此时B-pET30-cpca能有最佳表达。利用cpca上的His-tag标签,采用IMAC技术对CPC酰化酶进行纯化,纯化后的蛋白纯度达到90%以上。通过对CPC酰化酶催化性质的研究发现pH 10是CPC酰化酶催化的最佳pH,CPC酰化酶稳定性受pH影响并不大。CPC酰化酶活性随催化温度升高而升高,在55℃达到最高值。CPC酰化酶低温储存较稳定,在越高温度下储存失活越严重。22℃放置36小时,酶活损失约14%。对酶催化过程的研究表明,CPC酰化酶有较为严重的产物抑制。本论文的研究成果为CPC酰化酶在大肠杆菌中的高活性表达以及最终实现工业化生产奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 引言
• 1.1 头孢菌素类抗生素
• 1.1.1 基本结构
• 1.1.2 抑菌机理
• 1.1.3 市场状况
• 1.2 7-氨基头孢烷酸
• 1.2.1 生产方法
• 1.2.2 市场状况
• 1.3 头孢菌素酰化酶
• 1.3.1 分类和性质
• 1.3.2 克隆和表达
• 1.3.3 催化机理
• 1.3.4 CCA 活性的提高
• 1.4 在大肠杆菌中高效可溶性表达外源蛋白
• 1.4.1 影响外源蛋白表达量的因素
• 1.4.2 大肠杆菌的培养与诱导方法
• 1.5 论文的目的和意义
• 1.5.1 目的和意义
• 1.5.2 主要内容
• 第2章 材料与方法
• 2.1 引言
• 2.2 材料
• 2.2.1 菌种和质粒
• 2.2.2 酶与试剂
• 2.2.3 培养基
• 2.2.4 抗生素、诱导剂
• 2.2.5 缓冲溶液
• 2.2.6 发酵罐
• 2.2.7 软件
• 2.3 分子生物学与生物化学操作方法
• 2.3.1 聚合酶链式反应（PCR）
• 2.3.2 琼脂糖凝胶电泳
• 2.3.3 DNA 限制性内切酶酶切操作
• 2.3.4 双链DNA 末端的平滑化
• 2.3.5 DNA 连接反应
• 2.3.6 感受态细胞的制备与转化
• 2.3.7 菌落PCR
• 2.3.8 DNA 纯化与质粒提取
• 2.3.9 十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 2.4 菌的培养与保存
• 2.5 菌体超声破碎
• 2.6 固定化金属螯合层析
• 2.7 头孢菌素C 酰化酶酶活的测定
• 第3章 CPC 酰化酶基因的组成型表达
• 3.1 引言
• 3.2 pGEMKT-HPR-fcpca 质粒的构建
• 3.2.1 构建思路
• 3.2.2 PCR 扩增cpca 基因片段
• 3.2.3 酶切、连接和转化
• 3.2.4 菌落PCR 和质粒酶切验证
• 3.2.5 重组菌株的酰化酶活性验证
• 3.3 pGEMKT-oriP-cpca 质粒的构建
• 3.3.1 构建思路
• 3.3.2 PCR 扩增oriP 基因片段
• 3.3.3 酶切、连接和转化
• 3.3.4 质粒酶切及测序结果
• 3.3.5 重组菌株的酰化酶活性验证
• 3.4 结果分析
• 3.5 本章小结
• 第4章 CPC 酰化酶基因的诱导型表达
• 4.1 引言
• 4.2 pET28-cpca、pET30-cpca 重组质粒的构建
• 4.2.1 构建思路
• 4.2.2 PCR 扩增cpca 基因片段
• 4.2.3 酶切、连接和转化
• 4.2.4 菌落PCR 和质粒酶切验证
• 4.2.5 重组菌株的酰化酶活性验证
• 4.2.6 宿主的更换
• 4.3 PET30-cpca 质粒的片段切除及验证
• 4.3.1 构建思路
• 4.3.2 酶切、切平、连接和转化
• 4.3.3 质粒酶切验证
• 4.3.4 重组菌株CPC 酰化酶活性验证
• 4.4 cpca 诱导型表达体系比较分析
• 4.5 本章小结
• 第5章 CPC 酰化酶纯化及催化性质的研究
• 5.1 引言
• 5.2 CPC 酰化酶的纯化
• 5.2.1 粗酶液的制备
• 5.2.2 酶的纯化
• 5.2.3 纯化效果
• 5.3 pH 对CPC 酰化酶活性及稳定性的影响
• 5.3.1 pH 对CPC 酰化酶活性的影响
• 5.3.2 pH 对CPC 酰化酶稳定性的影响
• 5.4 温度对CPC 酰化酶活性及稳定性的影响
• 5.4.1 温度对CPC 酰化酶活性的影响
• 5.4.2 温度对CPC 酰化酶稳定性的影响
• 5.5 CPC 酰化酶催化过程研究
• 5.6 本章小结
• 第6章 结论
• 参考文献
• 附录A cpca 基因序列
• 附录B 启动子oriP 基因序列
• 附录C 酶活测定原始数据
• 致谢
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果