构建含木质素酶系基因工程菌降解植物的木质素

论文摘要

植物通过光合作用而再生,资源十分丰富。植物是良好的制造沼气和乙醇的原料,而木质素难于被降解,这是制约利用植物生产沼气和乙醇产业发展的瓶颈问题。本文研究构建和应用含木质素酶系(木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶)基因工程菌降解植物的木质素。应用反转录PCR扩增白腐真菌的木质素过氧化物酶基因和锰过氧化物酶基因,PCR扩增枯草芽孢杆菌的漆酶基因。分别构建含木质素过氧化物酶基因的表达载体、含锰过氧化物酶基因的表达载体和含漆酶基因的表达载体。用电转化的方法,分别将以上构建的表达载体转化毕赤酵母、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母,获得含木质素过氧化物酶基因的毕赤酵母工程菌、含锰过氧化物酶基因的毕赤酵母工程菌；含木质素过氧化物酶基因的酿酒酵母工程菌、含锰过氧化物酶基因的酿酒酵母工程菌、含漆酶基因的酿酒酵母工程菌；含木质素过氧化物酶基因的枯草芽孢杆菌工程菌、含锰过氧化物酶基因的枯草芽孢杆菌工程菌和含漆酶基因的枯草芽孢杆菌工程菌。将含木质素过氧化物酶基因的工程菌进行发酵,用发酵产物测定木质素过氧化物酶活性,其酶活性分别是：97U/ml发酵液(毕赤酵母工程菌),57.4U/ml(枯草芽孢杆菌工程菌),43.4U/ml(酿酒酵母工程菌)；将含锰过氧化物酶基因的工程进进行发酵,用发酵产物测定锰过氧化物酶活性,其酶活性分别是：0.933U/ml发酵液(毕赤酵母工程菌),1.870U/ml(枯草芽孢杆菌工程菌),0.580U/ml(酿酒酵母工程菌)：将含漆酶基因的工程菌进行发酵,用发酵产物测定漆酶活性,其酶活分别为：68.7U/ml(毕赤酵母工程菌),119.3U/ml(枯草芽孢杆菌工程菌),80.1U/ml(酿酒酵母工程菌)。分别用含木质素酶系(木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶)的同种工程菌的混合菌预处理水稻秸杆,同时以含木质素酶系的白腐真菌、氨水、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母预处理秸秆为对照,扫描电镜结果显示,经过4天预处理枯草芽孢杆菌工程菌混合菌和含毕赤酵母工程菌混合菌对于木质素的降解作用明显,不仅强于枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母工程菌、酿酒酵母对照组,也强于白腐真菌对照组和氨水对照组。将以上经过预处理的水稻秸秆发酵沼气7天,获得沼气量最多的是用含木质素酶系基因的枯草芽孢杆菌工程菌(混合菌)预处理的水稻秸秆,其次含木质素酶系基因的毕赤酵母工程菌(混合菌)。含木质素酶系的枯草芽孢杆菌工程菌的混合菌液预处理的水稻秸秆的产气量不仅极显著(P<0.001)多于酿酒酵母、毕赤酵母和枯草芽孢杆菌的产气量,也极显著(P<0.001)多于氨水、含木质素酶系基因的白腐真菌、酿酒酵母工程菌、毕赤酵母工程菌预处理水稻秸秆的产气量；含木质素酶系基因的毕赤酵母工程菌预处理水稻秸秆的产气量极显著(P<0.001)多于含木质素酶系基因的白腐真菌、氨水、酿酒酵母工程菌、毕赤酵母预处理水稻秸秆的产气量。综上所述,本文研究成功地构建了含木质素酶基因的枯草芽孢杆菌工程菌、毕赤酵母工程菌和酿酒酵母工程菌,实现了木质素酶基因在枯草芽孢杆菌工程菌、毕赤酵母工程菌和酿酒酵母工程菌中的分泌表达。尤其是证明了含木质素酶系基因的混合枯草芽孢杆菌工程菌和混合毕赤酵母工程菌具有高效的降解植物的木质素的功能。本文的研究为利用植物生产沼气和乙醇的预处理提供新的有效的新途径,有利于促进利用植物生产沼气和乙醇产业的发展。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 植物制备沼气和乙醇的研究进展
• 1.2 降解植物的木质素（lignin）的研究进展
• 1.2.1 木质素的理化性质
• 1.2.2 木质素的降解方法
• 1.2.2.1 物理法（Physical Methods）
• 1.2.2.2 化学法
• 1.2.2.2.1 酸处理
• 1.2.2.2.2 碱处理
• 1.2.2.3 生物法
• 1.2.3 木质素酶基因的研究进展
• 1.2.3.1 木质素过氧化物酶（Lignin Peroxidase,Lip）
• 1.2.3.1.1 理化性质
• 1.2.3.1.2 基因与异源性表达研究
• 1.2.3.2 锰过氧化物酶（Manganese peroxidase,MnP）
• 1.2.3.2.1 理化性质
• 1.2.3.2.2 基因克隆和异源性表达研究
• 1.2.3.3、漆酶（Laccase,Lac）
• 1.2.3.3.1 理化性质
• 1.2.3.3.2 基因克隆和异源性表达研究
• 1.3 外源表达系统的研究
• 1.3.1、枯草芽孢杆菌表达系统研究进展
• 1.3.2、巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展
• 1.3.3、酿酒酵母表达系统研究进展
• 1.4 本研究的目的和意义
• 1.5 本研究技术路线
• 第二章 工程菌的构建
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.1.1 菌株与载体
• 2.1.1.2 分子生物学常用工具酶、抗生素和试剂（盒）
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.1.3 常用培养基和试剂
• 2.1.3.1 常用培养基配方
• 2.1.3.2 常用试剂和缓冲液
• 2.1.3.2.1 质粒提取试剂
• 2.1.3.2.2 基因组DNA提取试剂
• 2.1.3.2.3 酶活检测试剂
• 2.1.4 试验方法
• 2.1.4.1 白腐真菌菌株基因组的提取
• 2.1.4.2 引物设计
• 2.1.4.3 PCR反应体系及反应条件
• 2.1.4.4 PCR反应产物的检测与回收
• 2.1.4.5 表达载体的构建
• 2.1.4.6 E.coil DH5a感受态的制备
• 2.1.4.7 重组子的鉴定
• 2.1.4.8 酵母工程菌构建
• 2.1.4.9 重组子的筛选
• 2.1.4.10 酶活检测
• 2.1.4.11 枯草芽孢杆菌工程菌的构建
• 2.1.4.12 枯草芽孢杆菌工程菌重组子的筛选
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 构建含有lip基因的工程菌
• 2.2.1.1 构建含有lip的表达载体
• 2.2.1.2 构建含lip基因的毕赤酵母工程菌及表达产物的酶活性分析
• 2.2.1.2.1 构建含lip基因的毕赤酵母工程菌
• 2.2.1.2.2 在毕赤酵母工程菌中分泌表达的liP的酶活性分析
• 2.2.1.3 构建含lip基因的枯草芽孢杆菌工程菌及其表达产物的酶活性分析
• 2.2.1.3.1 构建含有lip基因的枯草芽孢杆菌工程菌
• 2.2.1.3.2 在枯草芽孢杆菌工程菌中分泌表达的liP的酶活性分析
• 2.2.1.4 构建含有lip基因的酿酒酵母工程菌及其表达产物的酶活性分析
• 2.2.1.4.1 构建含有lip基因的酿酒酵母工程菌
• 2.2.1.4.2 在酿酒酵母工程菌中分泌表达的liP的酶活性分析
• 2.2.2 构建含有mnp基因的工程菌
• 2.2.2.1 构建含有mnp基因的表达载体
• 2.2.2.2 构建含mnp基因的毕赤酵母工程菌及表达产物的酶活性分析
• 2.2.2.2.1 构建含mnp基因的毕赤酵母工程菌
• 2.2.2.2.2 在毕赤酵母工程菌中分泌表达的MnP的酶活性分析
• 2.2.2.3 构建含有mnp基因的枯草芽孢杆菌工程菌及表达产物的酶活性分析
• 2.2.2.3.1 构建含有mnp基因的枯草芽孢杆菌工程菌
• 2.2.2.3.2 在枯草芽孢杆菌工程菌中分泌表达的MnP的酶活性分析
• 2.2.2.4 构建含mnp基因的酿酒酵母工程菌及表达产物的酶活性分析
• 2.2.2.4.1 构建含mnp基因的酿酒酵母工程菌
• 2.2.2.4.2 在酿酒酵母工程菌中分泌表达的MnP的酶活性分析
• 2.2.3 构建含lac基因的工程菌
• 2.2.3.1 构建含lac基因的毕赤酵母工程菌
• 2.2.3.2 构建含lac基因的枯草芽孢杆菌工程菌及其表达产物的酶活性分析
• 2.2.3.2.1 构建含lac基因的枯草芽孢杆菌工程菌
• 2.2.3.2.2 在枯草芽孢杆菌工程菌中分泌表达的Lac的酶活性分析
• 2.2.3.3 构建含lac基因的酿酒酵母工程菌及其表达产物的酶活性分析
• 2.2.3.3.1 构建含lac基因的酿酒酵母工程菌
• 2.2.3.2.2 在酿酒酵母工程菌中分泌表达的lac的酶活性分析
• 第三章 用工程菌预处理水稻秸秆
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 主要设备
• 3.1.3 实验方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 扫描电子显微镜镜镜检预处理后的水稻秸秆
• 3.2.2 沼气发酵结果
• 第四章 讨论
• 第五章 结论及创新之处
• 5.1 结论
• 5.2 创新之处
• 参考文献
• 附录一 缩写词（Abbreviation）
• 附录二 lip基因与基因编号X12698.1序列的比对
• 附录三 mnp基因与基因编号为J04624.1序列的比对
• 后记