藤黄微球菌快速检测方法的建立及rpf基因的表达

论文摘要

藤黄微球菌（Micrococcus luteus，M．luteus）为专性需氧革兰氏阳性细菌，广泛分布与空气、水、土壤中，也见于人与动物皮肤、咽部、眼睛等部位，是人和动物的条件致病菌，但其致病性、耐药性、和检测方法鲜有研究。鉴此，本论文进行了四个方面的研究：对从永州、浏阳、澧陵、茶陵等猪场分离的藤黄微球菌进行了鉴定；藤黄微球菌PCR检测方法的建立；环媒恒温扩增技术（LAMP）应用于藤黄微球菌的检测；RPF因子的原核表达的研究，结果如下：对病原菌藤黄微球菌进行了分离鉴定病猪部分脏器的病理学变化进行了观察，结果表明该病原为藤黄微球菌变种Ⅲ；病理解剖变化是广泛性组织损害；组织病理学变化是肝脏细胞和淋巴结的变性与坏死，胃、肠黏膜上皮细胞坏死、脱落以及肺的充血和出血，肝、脾、等实质性器官有针尖状出血点，大部分组织炎性细胞浸润。根据藤黄微球菌23SrRNA基因序列设计了一对特异性引物，通过优化扩增条件，成功地建立了一种快速、灵敏、准确的PCR检测法。检测大肠杆菌、沙门氏杆菌、链球菌等九种其他病原菌为阴性，对自然感染猪的临床样品U32株抽提的DNA为模板，扩增结果为阳性。结果表明，该法检测藤黄微球菌准确性高。本法扩增藤黄微球菌产生的特异性片段为1326 bp，最低检出浓度为1058 CFU／mL。基于藤黄微球菌23S rRNA基因之1125-1323bp区设计出F3、B3、FIP、BIP特异性引物，通过优化扩增条件，建立了一种新的基因扩增方法-环媒恒温基因扩增（LAMP）。特异性与敏感性的评估时，用7个参考株和大肠埃希菌等八种其他临床病原菌检验本检测法，结果表明，环媒恒温基因扩增法检测藤黄微球菌快速、灵敏高、特异性强。根据GenBank中发表的rpf基因全长序列设计一对特异性引物，PCR扩增获得一个大小为564bp的DNA片段，再将其克隆到表达载体pET32a中，并转化至宿主菌BL21（DE3）中获得了高效表达。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 藤黄微球菌及其研究进展
• 1.1 藤黄微球菌的生物学特征
• 1.2 藤黄微球菌的分类
• 1.3 藤黄微球菌致病性
• 1.4 致病机理与感染动物模型
• 1.5 藤黄微球菌的抗药性
• 2 环介导等温基因扩增技术及研究概况
• 2.1 LAMP法的原理
• 2.2 LAMP的操作步骤
• 2.3 研究进展
• 2.4 结语
• 第二章 猪源藤黄微球菌分离鉴定与病理学观察
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 临床症状
• 2.2 病理解剖学变化
• 2.3 组织病理学变化
• 2.4 病原学检查
• 3 讨论
• 3.1 病原学鉴定
• 3.2 治疗
• 4 小结
• 第三章 猪源藤黄微球菌PCR检测方法的建立与应用
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 标准株检测实验
• 2.2 PCR条件的确立
• 2.3 PCR特异性试验
• 2.4 PCR敏感性试验
• 2.5 PCR临床检测
• 2.6 阳性克隆的鉴定与序列分析
• 3 讨论
• 3.1 基于细菌16、23SrDNA的基因检测法
• 4 小结
• 第四章 环媒恒温基因扩增（LAMP）检测藤黄微球菌的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 LAMP检测方法的建立与条件的确立
• 2.2 LAMP反应体系的确立
• 2.3 LAMP特异性试验
• 2.4 LAMP敏感性试验
• 2.5 LAMP样品检测结果
• 3 讨论
• 3.1 LAMP快速检测方法
• 3.2 LAMP法的条件优化
• 3.3 LAMP法的灵敏性
• 3.4 LAMP法建立的要点和注意事项
• 3.3 LAMP法的优点
• 4 小结
• 第五章 rpf基因在大肠杆菌中的表达
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 表达引物的设计
• 2.2 重组表达载体的构建
• 2.3 rpf-pET32a（+）的原核表达
• 3 讨论
• 3.1 rpf基因结构
• 3.2 RPF因子的原核表达
• 3.3 基因信号肽的剔除
• 3.4 rpf基因表达的意义
• 4 小结
• 第六章 结论及下一步工作设想
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介