氧化应激对支气管上皮细胞CFTR门控功能及调控机制研究

论文摘要

目的:在气道炎症或气道高反应（airway hyperresponsiveness,AHR）中,气道粘液分泌量异常增多,粘液组成成分也发生改变,容易形成气道粘液栓,是气道阻力增高的重要病理机制。气道上皮细胞粘液分泌的数量及组成成分取决于某些离子通道的功能活性及表达密度,其中囊性纤维化跨膜转导调节因子（Cystic fibrosis transmembraneconductance regulator,CFTR）尤为人们所关注。CFTR是一种磷酸化调控的上皮细胞Cl-通道,主要位于气道上皮细胞顶侧膜,借助其对Cl-的跨膜转运,在跨上皮盐类物质转运、水分流动和离子浓度调节中发挥重要作用。CFTR功能缺陷的患者分泌的粘液成分也与正常人很不一样,粘液包含有细菌感染产物、粘液脂质、肌动蛋白、蛋白酶等,使得其含有更多的非蒸发性的固体成分,增加粘液的稠度,降低粘液清除率和粘液运输效率,容易诱发气道炎症和形成气道粘液栓。基于以上的部分线索,本课题提出“气道上皮细胞CFTR门控功能及表达调节参与气道功能稳态,其缺陷可能与AHR形成机制有关”。方法与结果:1)氧化应激抑制支气管上皮细胞CFTR表达及信号机制我们用臭氧连续应激大鼠3天,每天1小时建立气道高反应动物模型,免疫荧光结果显示,正常大鼠支气管上皮顶膜及胞浆中可见较多的红色染色的CFTR,而臭氧应激的大鼠支气管上皮顶膜及胞浆中CFTR明显减少。我们应用臭氧攻击BECs 30min,建立氧化应激模型。Real-time PCR结果显示,臭氧应激4h后,CFTR mRNA表达明显下降。免疫荧光显示正常BECs胞膜有较强的CFTR染色,臭氧处理后,CFTR。在膜及胞浆均明显下降。Western blot结果显示臭氧应激4h后,CFTR蛋白明显下降。全细胞膜片钳结果发现,在没有激动剂的情况下,记录的CFTR cl-电流很小,在加入5μM forskolin,记录出明显的CFTR cl-电流,在forskolin的基础上,可观察到臭氧应激4h后的BECs CFTR cl-电流下降。在随后的试验中,发现这种cl-电流能被CFTR cl-电流抑制剂glibenclamide阻滞,而不能被非CFTR cl-电流抑制剂DIDS所阻断,说明记录出的cl-电流是CFTR cl-电流。为了研究氧化应激抑制BECs CFTR表达的信号机制,在臭氧应激前,BECs被JAK2激酶抑制剂AG490（10μmol/L）预处理4h,Real-timePCR结果发现臭氧应激后,AG490能增加CFTR mRNA的表达,AG490单独处理对CFTR mRNA的表达没有影响。免疫荧光和Western blot结果均显示AG490预处理能增加CFTR蛋白的表达。随后Western blot结果显示在未受臭氧处理的BECs,STAT1蛋白的磷酸化水平很小,在臭氧处理后,STAT1的磷酸化水平随时间依赖性增加。在前期实验中我们已发现臭氧应激后,小分子NO、CO、ROS增加。为了了解这些小分子是否参与臭氧诱导的STAT1的磷酸化。应用这些小分子抑制剂预处理BECs,免疫荧光和Western blot结果显示AG、ZnPP-9、NAC均降低了臭氧诱导的STAT1的磷酸化。我们还对信号分子抑制剂是否调节臭氧应激后CFTR的表达进行了研究。Real-time PCR和Western blot结果显示AG,NAC预处理能增加臭氧应激后CFTR的表达,而ZnPP-9则影响不明显。2) VIP激活支气管上皮细胞CFTR转运及通道活性CFTR转运涉及到四个过程,最终调节细胞和膜上CFTR的水平。1)CFTR合成及构想成熟后,从ER转运至胞膜表面;2)在细胞膜表面,CFTR通过小泡以及酪氨酸为基础的基序发生内吞作用,CFTR从胞膜内陷至内涵体;3)胞吞的CFTR CFTR循环回胞膜上;4)胞吐的CFTR发生降解。CFTR只有在胞膜上才能对Cl-的跨膜转运,在跨上皮盐类物质转运、水分流动和离子浓度调节中发挥重要作用。为了解CFTR的转运过程,我们通过以下实验来观察。免疫荧光结果发现VIP作用以后,循环回胞膜的CFTR增多,VIP促进了CFTR向胞膜的循环。免疫共沉淀结果显示正常BECs既表达成熟型CFTR（BandC）,又表达非成熟型CFTR（Band B）。臭氧降低了成熟型CFTR的表达,而VIP则增加了成熟型CFTR的表达。Western blot结果显示臭氧降低了胞膜和总CFTR的蛋白水平,VIP增加了胞膜和总CFTR的蛋白水平,VIP促进了CFTR向膜的转运。随后我们研究VIP对BECs上CFTR依赖的cl-转运的调控机制进行了研究。采用氯离子敏感荧光染料MQAE检测胞内cl-浓度和氯化物的分泌,结果发现VIP具有与forskolin一样增加胞内cl-浓度和氯化物的溢出的特性,并随浓度升高而增大。全细胞记录结果显示在VIP的作用下,CFTR Cl-电流密度增加,并具有浓度依赖性,在10-8mmol/L为最大半数有效剂量。CFTR Cl-阻断剂glibenctamide能阻断该电流,而非CFTR Cl-阻断剂不能阻断该电流。我们应用PKA阻断剂H89,结果发现H89部分阻断了VIP激活的CFTR Cl-电流;应用PKC阻断剂H7（200μM）,同样结果发现H7部分阻断了VIP激活的CFTR Cl-电流。在BECs上存在着多种VIP受体（VPAC）,我们应用(10-8-10-10M)VIP受体拮抗剂,结果发现VIP受体拮抗剂能剂量依赖性抑制VIP激活的CFTR Cl-电流。3) CFTR基因表达调控研究为了进一步探讨臭氧应激后CFTR的基因表达调控机制,我们对臭氧应激条件下CFTR的转录因子调节谱进行了研究。实验首先用TESS软件对CFTR启动子区转录因子结合位点进行搜索,然后根据搜索结果,设计了6条探针,覆盖所有的转录因子结合位点,应用EMSA和ChIP的方法筛选了调控CFTR表达的转录因子。结果显示探针5、6有探针与蛋白结合形成的滞后带,能被100倍未标记探针所竞争,为特异性结合。通过突变探针结合实验和抗体超迁移实验,证实这2条探针结合的转录因子分别为Spl、ERa。臭氧应激4h后,降低了这两种转录因子的DNA结合活性。ChIP实验显示,Spl和ERa可特异性与CFTR启动子结合。紧接着,我们用基因定点突变技术观察了两种转录因子对CFTR启动子活性的影响,结果显示Spl与ERa的结合位点突变后,CFTR启动子活性下降,Spl与ERa结合位点同时突变,可几乎到达到臭氧应激对CFTR的抑制。随后,我们用反义寡核苷酸技术观察了两种转录因子对CFTR表达的影响,Western证实了两种ASOs的有效性,他们可分别阻断两种转录因子的蛋白表达。应用两种ASOs后,我们用real-time PCR和Western观察到,Spl和ERa ASO处理可降低CFTR的表达。通过进一步的研究,我们用EMSA观察到ERa与Spl的结合活性在0-1h之间激活,于应激后2h开始下降。real-time PCR检测CFTR的表达与臭氧应激后ERa和Spl的转录活性一致。我们还用免疫荧光观察到臭氧应激4h后,Spl核转位降低。臭氧应激4h后,Spl,ERa与CFTR的启动子区的结合活性及核转位降低,抑制CFTR转录。综上所述:本研究观察到臭氧应激抑制了BECs上CFTR的表达及功能,这为本课题提出的非CF疾病的气道炎性疾病中CFTR的功能下降提供了依据。研究还观察到臭氧应激后,NO、ROS产生增多,参与并激活了STAT1的磷酸化,抑制了CFTR的表达,臭氧应激还使Spl,ERa与CFTR的启动子区的结合活性及核转位降低,抑制CFTR转录。另外本研究研究了VIP激活了CFTR的转运及门控特性,PKA和PKC途径通过调节CFTR调节区上的磷酸化位点调节了CFTR的通道功能,为治疗包括CF疾病在内的气道炎性疾病因CFTR功能下调引起的黏液粘稠问题提供了选择。结论:臭氧应激抑制了BECs上CFTR的表达及功能。其机制如下:（1）臭氧应激抑制了CFTR的表达。其途径有早期信号分子NO和ROS的产生,进而激活JAK/STAT途径参与臭氧应激抑制CFTR的表达。臭氧应激还使转录因子Spl,ERa与CFTR的启动子区的结合活性及核转位降低,抑制CFTR转录;（2）臭氧应激抑制CFTR cl-电流,VIP激活了CFTR cl-电流,PKA和PKC途径参与了其调控过程;（3）VIP增加了CFTR向胞膜的转运。主要是通过增加CFTR循环回胞膜,增加175kD成熟型CFTR的表达及增加胞膜CFTR蛋白的表达这三个过程来实现的。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 第二章 氧化应激对支气管上皮细胞CFTR表达调控及信号机制
• 2.1 材料与方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 第三章 VIP激活支气管上皮细胞CFTR转运及通道活性
• 3.1 材料与方法
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 第四章 CFTR基因表达调控研究
• 4.1 材料与方法
• 4.2 实验结果
• 4.3 讨论
• 第五章 结论
• 第六章 综述
• 第七章 参考文献
• 第八章 致谢
• 第九章 攻读学位期间主要的研究成果