杨茂伟1高志达1梁栋1杨蕾1（中国医科大学附属第一医院骨科辽宁沈阳110001）
基金项目：辽宁省博士启动基金资助项目(20071044)；沈阳市科学技术计划项目（1091136-9-03）。
作者简介：杨茂伟(1969-)男，副教授，博士生导师。【摘要】目的：制备氟伐他汀钠-PLGA复合薄膜，并对其体外释药性能进行相关评价。方法：将一定剂量氟伐他汀钠分别与125mgPLGA溶于5mL二氯甲烷，载药量为25mg,50mg,75mg，快速搅拌(1800r/min)5min，自然挥发溶剂一段时间后真空干燥，得到均匀的氟伐他汀钠-PLGA复合薄膜。在PBS缓冲液中进行体外释药实验，使用高效液相色谱法(HLPC)[1]绘制累积释药曲线。结果：3种复合膜20d内累积释放量分别为9558%、96.60%、98.51%，在5～20d释药后期药物释放平稳而缓慢。结论：制备得到了缓释时间为20天的氟伐他汀钠-PLGA复合膜,其缓释时间及缓释特性能够满足下一步的动物体内试验，具有潜在的临床应用需要。
【关键词】氟化他汀；复合膜；体外释药；缓释
【中图分类号】R94【文献标识码】C【文章编号】1008-6455（2010）10-0201-02
氟伐他汀(fluvastatin)[2]是第一个全化学合成的降胆固醇药物,为羟甲戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂,是一种优良的降血脂药，几年来不断有实验研究[3]和临床流行病学调查[4]结果显示：他汀类药物具有刺激骨形成、恢复骨骼细微结构、增加骨强度及降低骨折风险等[5]作用，是一类新兴的极有潜力的促进骨形成药物。临床中常用的氟化他汀钠为胶囊、片剂等普通制剂，由于其半衰期只有0.5小时-1.2小时，临床使用促进骨折愈合时需每日多次口服，血药浓度波动大。生物可降解高分子材料PLGA（聚乳酸一乙醇酸共聚物）是一种常用药物控制释放的载体[6]，具有良好的可降解性能以及生物相容性[7,8]。本文的主要目的是制备氟伐他汀-PLGA复合薄膜，并对其体外释药性能进行相关评价，为促骨折愈合复合膜的制备开展前期探索性研究。
1材料与方法
1.1仪器和试药:氟化他汀钠，由浙江霍姆顿化工有限公司提供；PLGA（PLA/PGA=80∶20），由山东济南岱罡生物科技公司提供,分子量60000；二氯甲烷（分析纯）由沈阳市第一试剂厂提供；甲醇（色谱纯）由天津化工厂提供。Model500seriesⅢ高效液相色谱仪（美国SSI）；色谱柱（迪马科技公司）；DZF-6050型真空干燥箱(上海博迅实业有限公司)，模具（自制）3cm×3cm×2cm，微量过滤器（有机系，0.45μ）；微量进液器（上海安亭微量进样器厂）；THZ-C恒温振荡器(江苏太仓实验仪器厂)；透析袋（截留分子质量为3000上海绿鸟科技发展有限公司）；HJ-5多功能搅拌机（江苏金坛市环宇科学仪器厂）
1.2氟伐他汀钠-PLGA复合薄膜的制备
（1）用电子天平精密称取3份不同剂量氟伐他汀钠与125mgPLGA共同溶于5mL二氯甲烷，充分溶解；快速搅拌(1800r/min)5min，使其充分混匀；
（2）将混合液静置于蒸发模具中，在温度15℃,相对湿度30%RH下,保证其厚度相同,待溶剂挥发完全后,将模具于真空干燥箱中75℃挥发48小时；
（3）最后用刀片将模具底部的薄膜取下，得到3片厚约0.5mm，长宽3×2cm，均匀的氟伐他汀钠-PLGA复合薄膜，使其药物含量分别为25mg、50mg和75mg，并分别标记为25、50和75；
（4）另用此方法制备纯PLGA薄膜，标记为PLGA。剪裁成相同尺寸备用。
1.3高效液相色谱
色谱条件
色谱柱：diamonsilC18(200mm×4.6mm，5μm)；流动相:甲醇-10mmol·L-1，KH2PO4(75:25，用H3PO4调pH2);流速：1mL／min；柱温：25℃检测波长：234nm；进样体积：20μL。
1.4载药膜片体外释药实验方法：载药膜片药物体外释放效能的测定根据薄膜的载药量主要分3个实验组，在观察其释放规律的同时为以后的体内实验做准备工作
1.4.1将同等大小将标记为25，50，75及PLGA的复合膜放入分子量为3500的透析袋中并在其中放入一些释放介质，将膜片放入其中并用夹子夹住透析袋分别加入250mLPBS缓冲液(pH=7.4)，该体系置于37℃±0.5℃的水浴振荡器环境中避光放置；在药膜边缓释边震荡的过程中使PBS缓冲液含药量均匀一致。
1.4.2于0h、0.5h、1h、3h、5h、8h、15h、26h、50h、74h、134h、206h、360h、480h不同时间间隔点定时用取样器取样（透析袋外液）0.1mL，并且每次取样后向原缓冲液中及时补加0.1mLPBS液，用微量滤过器过滤液体，从中用微量进样器抽取0.02ml过滤后溶液样品。样品分别在234nm下测定A，计算得出相应浓度。
2实验结果
2.1专属性检测:PLGA膜缓释溶液(360h)色谱图（图1）和氟伐他汀钠-PLGA复合膜缓释溶液(360h)色谱图(图2)在氟伐他汀钠出峰位置（5.8分钟）或接近出峰位置未发现任何明显有效杂质峰干扰，说明本系统的专属性比较好。
.
2.2线性关系:精确称取6mg氟伐他汀钠到20ml量瓶中，用去离子水溶解并稀释至刻度，混匀，作为储备液。分别精取储备液1.0mL、20mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL、6.0mL、7.0mL、8.0mL、9.0ml、置于10mL容量瓶中，用去离子水溶解并稀释到刻度，混匀，即得到浓度分别为30μg／mL，60μg／mL,90μg／mL,120μg／mL,150μg／mL,180μg／mL,210μg／mL,240μg／mL，270μg／mL的溶液。照上述色谱条件进样，记录色谱图，量取主峰峰面积，以峰面积（A）和浓度(C)作线性回归，以最小二乘法得回归方程为A=50.241C一11.1，r=09998。分析表明氟伐他汀钠在30μg／mL一270μg／mL浓度范围内该方法具有良好的线性。
.
2.3氟伐他汀药膜在37℃的长期释放结果见表1。结果表明，三种不同剂量的药膜在360h内释放分别达到94.10％，97.78％，99.57％，缓释效果较好。分别计算不同时间点NP的累积释药百分率(表1)。
表1不同载药量缓释片30d内氟伐他汀钠体外累积释放百分量
.
2.43种PLGA制备的药膜都有比较明显的突释效应，而且3种药膜突释效果基本相同见图3。因为在释放初期，聚乳酸尚未降解或降解很少，药物的释放主要是由药物在膜表面及内外的浓度差引起的，即水性介质渗透进入药膜，药物扩散释放。当聚乳酸分子量较大时，扩散层较厚，导致药物扩散困难，释放速率降低。本实验制备的药膜用于局部给药，适当的突释可以在治疗部位短时间内达到有效浓度，但若突释过大，会造成药物局部浓度过大，产生不良反应，不利于治疗，因此该实验为以后的动物体内实验提供依据。
.
3讨论
随着中国人口老龄化的加剧，骨折的性质与以前发生了明显的变化，骨质疏松骨折逐年上升[9]，但临床上针对骨质疏松骨折的相关药物治疗均为全身给药，但全身给药要在局部发挥治疗作用需要剂量较大且副作用明显为大部分患者所不能接受，因此临床急需一种能够在局部形成比较大的药物浓度，不良反应又少的替代疗法，因此本论文所研究的氟伐他汀复合膜有明显的优势。
氟化他汀钠作为一种人工合成的人工合成的HMG-CoA还原酶抑制剂，具有结构相对比较简单、作用具有选择性和不良反应发生率低等优点。其促进骨折愈合的机制主要是通过增强骨形成蛋白(bonemorphogeneticprotein-2,BMP-2)的表达，增加BMP-2mRNA及蛋白水平[10],细胞增殖成熟及新骨形成实现，除了刺激骨形成以外还可能以与二磷酸盐类似的途径抑制破骨细胞[10]，抑制骨吸收，具有明确的促进骨折愈合作用。但氟伐他汀钠口服途径吸收不佳，仅不到5％可进入循环系统且需经过肝脏代谢，因此循环药物水平较低。虽然他汀类药物在骨折断端浓度尚不了解，但毫无疑问成骨细胞及破骨细胞将暴露于较低浓度的药物之中；同时其半衰期过短，只有0.5-1.2小时，临床应用不得不短时间内反复给药，降低患者依从度。氟伐他汀应用于促进骨折愈合受到以上两个因素限制，因而发展氟伐他汀的骨折局部植入缓释剂型成为一种可行的解决方案。
对于某一种药物，PLGA缓释系统的总释药时间主要取决于合成PLGA的PLA与PGA的比例，该比例越高则缓释时间越长，而过高的PLA/PGA比例则会导致严重的突释现象，在这个阶段释放的药物对于长期释放来说是无效的，更严重的是过高的药物浓度可能会产生不良反应。本实验在预实验中考察了多种合成比例的PLGA，最后选择缓释时间与突释现象相对均较理想的PLGA(80/20)为缓释载体。
体外释放曲线表明复合膜在前24h内对氟伐他汀的释放均有明显的突释，释药百分比约为45，然后释放较为平稳，基本上呈匀速释放，经过20d释放后，累计释药百分比约为99．9％，缓释时间可覆盖骨折愈合的前期。该体系的释放时间比较适合于临床实际应用，即在骨折清创缝合时将该复合膜植入骨折断端，即可在20天范围内持续释放氟伐他汀，同时减少药物的给药次数。增加患者的顺应性,提高治疗效果,减少用药的总剂量。并且PLGA的分解产物为乳酸和羟基乙酸，参与体内代谢，不需要再次手术取出。
实验考察了三种不同载药浓度的复合膜，结果显示三种复合膜的时间释药百分比基本相同，复合膜的释药行为与载药浓度没有直接关系，但释放量随着浓度增长而逐渐加大，如何在安全药物浓度范围内提升载药量有待在后续实验中进行研究。
综上所述，本实验制备得到了可在20天范围内较稳定释放氟伐他汀的PLGA复合膜，基于这种复合膜的潜在优势，将对促进骨折愈合方面提供新的治疗方法。
参考文献
[1]Al-RawithiS,HusseinRF,AlzahraniA.Sensitiveassayforthedeterminationoffluvastatininplasmautilizinghigh-performanceliquidchromatographywithfluorescencedetection[J]TherDrugMonit.2003Feb;25(1):88-92
[2]LawrenceJM,RecklessJPFluvastatin[J]ExpertOpinPharmacother.2002Nov;3(11):1631-41
[3]JMundyG，GarrettR，HarrisS，etal．Stimulationofboneformationinvitroandinrodentsbystatins[J]．Science，1999，286：1946-1949
[4]RejnmarkL,OlsenML，JohnsenSP，etal．Hipfractureriskinstatinusers-apopulation-basedDanishcase-controlstudy[J]．Osteoporoslnt，2004，15：452-458
[5]RyszardGalus,PawelWlodarski,KrzysztofH,Influenceoffluvastatinonboneformationinducedbydemineralizedbonematrixinmice[J].PharmacolRep.2006May-Jun;58(3):443-7
[6]WuC,RamaswamyY,ZhuY,etal．Theeffectofmesoporousbioactiveglassonthephysiochemical,biologicalanddrug-releasepropertiesofpoly(DL-lactide-co-glycolide)films[J]Biomaterials.2009Apr;30(12):2199-208.Epub2009Feb8
[7]ZilbermanM，EberhartRC，SchwadeND．Invitrostudyofdrug-loadedbioresorbablefilmsandsupportstructures[J]．JBiomaterSciPolymEd，2002，13(11)：1221-1240
[8]ZilbermanM，SchwadeND，MeidellRS，eta1．Structureddrug-loadedbioresorbablefilmsforsupportstructures[J]．JBiomaterSciPolymEd，2001，12(8)：875-892
[9]赵刚,胡侦明,劳汉昌,等.昆明地区部分老年人群骨质疏松性骨折发病率初步调查和分析.中国骨质疏松杂志,2007，13(4):257-259
[10]MontagnaniA,GonnelliS,CepollaroC,etal.Effectofsimvastatintreatmentonbonemineraldensityandboneturnoverinhypercholesterolemicpostmenopausalwomen:a1-yearlongitudinalstudy[J].Bone,2003;32(4):427-433