（海南医学院海南省药物安全性评价研究中心海南海口571199）
【摘要】目的：对铜绿假单胞菌注射液的毒力、免疫力及生物学活性测试方法进行测试。方法：依据中国药典2010年版第二增补本中对铜绿假单胞菌注射液毒力、免疫力及生物学活性测试的要求，其中简化了淋巴细胞混悬液制备的步骤以及缩短供试品溶液制备时的离心时间。结果：主种子和工作种子的LD50均为7.65×10-8个/mL；主种子和工作种子对小鼠的保护率分别为80%和76.7%；供试品稀释至1:100时，生物活性刺激指数为2.15。结论：所选用铜绿假单胞菌注射液的毒力、免疫力及生物学活性测试均符合标准。
【中图分类号】R96【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2017）26-0153-02
铜绿假单胞菌注射液是用铜绿假单胞菌（MSHA菌毛株）培养后，取菌苔制成悬液，加1%（mL/mL）甲醛杀菌后用PBS稀释制成[1]。现有检测铜绿假单胞菌注射液生物学活性最为有效的方法是药典标准中采用MTT法的脾淋巴细胞增殖试验。本试验对铜绿假单胞菌注射液其中的毒力、免疫力试验进行测试，并对生物学活性测试中部分操作步骤进行了改进。
1.材料与方法
1.1材料
1.1.1样品铜绿假单胞菌注射液由海口市奇力制药股份有限公司提供。
1.1.2动物SPF级BALB/c小鼠购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物合格证号№43004700030208。
1.1.3试剂RPMI1640细胞培养液购于gibico，胎牛血清购于杭州四季青生物工程材料有限公司，噻唑兰(MTT)购于Sigma，二甲基亚砜（DMSO)购于西陇化工股份有限公司，氯化铵和三羟甲基氨基甲烷购于阿拉丁。
1.2方法
1.2.1毒力、免疫力试验毒力、免疫力试验方法参照药典标准[1]，分别计算LD50和小鼠保护率。
1.2.2BALB/c小鼠脾淋巴细胞的制备先按药典标准制备小鼠脾淋巴细胞备用[1]。改进方法为：取脾脏后置于无菌玻璃培养皿中，加入约10mL含5%胎牛血清的RPMI1640培养液，用眼科剪将脾脏剪碎后过100目不锈钢筛网，收集分离的脾细胞悬液，1000r/min离心5min，弃上清，加入预冷的红细胞裂解液并吹打均匀，置于2～8℃冰箱5min，1000r/min离心5min，弃上清。用5%胎牛血清培养液离心洗涤2～3遍后重悬细胞，配制成每1mL含1×107个细胞的脾淋巴细胞悬液，置37℃备用。以上操作均在无菌条件下进行。
1.2.3生物学活性检测样品的制备具体步骤参照药典标准，将其中的离心时间60min改为30min。
1.2.4生物学活性测定方法具体步骤参照药典及相关标准[1、2]，在96孔板中先加入100μL/孔的脾淋巴细胞混悬液，然后不同浓度给药组分别加入100μL/孔的药液，阴性对照加入100μL/孔的RPMI1640培养液，空白对照直接加200μL/孔的培养液，CO2培养箱常规培养72h后，每孔加入25μLMTT溶液（5mg/mL），继续培养4h。2000r/min离心20min，弃上清，每孔加入100μLDMSO，酶标仪检测OD值，波长570nm，检测前震荡5～10min。计算刺激指数(SI)=(供试品平均吸光度－空白对照平均吸光度)/(阴性对照平均吸－空白对照平均吸光度)。
2.结果
2.1毒力试验
取37℃培养20h的铜绿假单胞菌主种子和工作种子营养琼脂培养物，用无菌0.9%（g/mL）氯化钠注射液分别稀释成含菌1.2×109个/mL、8.0×108个/mL、4×108个/mL、2×108个/mL浓度菌液，腹腔注射体重14～16gBALB/c小鼠，每个浓度注射6只，雌雄各半，每只0.3mL，观察7d，主种子和工作种子铜绿假单胞菌对BALB/c小鼠的LD50均为7.65×108个/mL。
2.2免疫力试验
取37℃培养20h的铜绿假单胞菌主种子和工作种子营养琼脂培养物，以浓度为1%（mL/mL）的甲醛溶液杀菌后，用无菌0.9%（g/mL）氯化钠注射液分别稀释成含菌1.8×109个/mL，皮下注射致敏3次，每隔5日致敏1次，共30只，每只0.5mL。末次致敏后8d腹腔注射2.3×109个/mL活菌进行攻击。结果表明，主种子和工作种子铜绿假单胞菌对BALB/c小鼠的保护率分别为80%和76.7%。
2.3生物学活性试验
所检测铜绿假单胞菌注射液样品稀释至1:100时，采用药典方法和改进方法检测生物活性刺激指数分别为2.15和2.21，差异无统计学意义，P＞0.05。
3.讨论
在脾淋巴细胞的制备实验中，本实验为对脾脏进行研磨，直接将脾脏剪碎过筛，同样可以制备充足的脾淋巴细胞，而且制备的细胞悬液中杂质、碎片较少。同一批样品采用简化后的方法与采用药典标准同时进行实验所得结果比较并无明显的差异。简化后的MTT法检查铜绿假单胞菌注射液生物学活性测试方法更有利于实验的操作并有效缩短实验时间。
【参考文献】
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].第二增补本.北京：化学工业出版社，2010：402-405.
[2]王琨，胡大利，周雨朦，等.铜绿假单胞菌注射液生物活性体外分析方法的应用[J].中国药学杂志，2013，48（18）：1574-1577.