论文摘要
第一部分环状RGD肽固定天然支架的结构表征研究第一节环状RGD肽的合成目的制备含有RGD（精-甘-天冬氨酸）基序环肽。方法Fmoc固相合成法制备cyclo-RGDfK（精-甘-天冬-D-脯-赖氨酸）线肽,利用活泼酯法使线肽首尾成环,形成环状肽链,高效液相色谱分析和质谱法鉴定。结果cyclo-RGDfK合成后,色谱分析其纯度为99.02%,质谱检测分子量为603.70g/mol。结论cyclo-RGDfK可利用化学方法常规合成,用于组织工程。第二节RGD肽与去细胞瓣的共价连接目的检测环状RGD肽固定去细胞瓣的可行性。方法酶+去污剂的方法制备去细胞猪主动脉瓣,EDC使cyclo-RGDfK肽与去细胞瓣共价结合,采用差减法（difference method）计算RGD肽与瓣膜支架的结合率。结果依据RGD肽浓度-吸光度标准曲线计算结果,证明RGD已牢固固定于瓣膜支架。结论化学接枝法可实现RGD序列对去细胞瓣的表面修饰。第二部分肌成纤维细胞原代培养及生物学性状研究目的获取大鼠主动脉肌成纤维细胞（myofibroblasts, MFBs）作为种子细胞。观察原代培养的MFBs生长特性,并对其特异性细胞标记物α-肌动蛋白（alpha-smooth muscle actin,α-SMA）和Vimentin（波形蛋白）分子鉴定。方法组织块法原代培养MFBs,传至4-5代细胞备用。MTT法绘制细胞生长曲线,免疫荧光法标记α-SMA和Vimentin分子在MFBs中的表达。结果光镜下观察细胞增殖旺盛,形态、大小一致。MFBs高度表达α-SMA和Vimentin分子。结论体外原代培养较易获取大鼠主动脉肌成纤维细胞,其生物学性状类似于瓣膜间质细胞（valvular interstitial cells, VICs）,可作为种子细胞用于构建组织工程瓣膜。第三部分RGD肽固定天然支架构建组织工程瓣膜的实验研究第一节RGD肽固定天然支架及细胞黏附形态学观察目的探讨环状RGD短肽（精-甘-天冬-D-脯-赖氨酸,Cyclo-RGDfK）提高去细胞瓣对肌成纤维细胞（myofibroblasts, MFBs）的黏附性能方法将去细胞瓣随机分为三组（每组n=7）, A组,去细胞瓣未接受任何预处理;B组,去细胞瓣与EDC反应36h;C组（实验组）去细胞瓣与交联剂EDC反应36h,再与Cyclo-RGDfK反应24h,使RGD肽共价结合于去细胞瓣。将第5代myofibroblast分别接种至各组瓣膜上。HE染色和扫描电镜观察细胞黏附增殖情况。结果HE染色和扫描电镜显示MFBs在C组生长明显好于A组和B组,瓣膜表面细胞密集,生长旺盛,几乎覆盖整个支架表面,细胞形态均一、排列规则。而A组和B组瓣膜支架表面细胞数量较少,形态、大小不一致,排列紊乱,胶原裸露。结论Cyclo-RGDfK显著促进MFBs在去细胞瓣表面黏附,继而促进细胞在支架表面生长、增殖。第二节细胞黏附性能改善的分子生物学机制研究目的探讨Cyclo-RGDfK提高去细胞瓣对肌成纤维细胞MFBs黏附性能的分子机制及Cyclo-RGDfK对IntegrinαVβ3基因表达的调控。方法半定量RT-PCR检测IntegrinαVβ3基因在各组表达的差异。结果定量PCR示IntegrinαVβ3 mRNA在实验组（C组）表达显著高于对照A组和B组,且αVβ3表达差异与MFBs生长增殖差异一致。结论Cyclo-RGDfK显著促进种子细胞在去细胞瓣上的黏附,此效应可能与RGD肽上调IntegrinαVβ3基因表达有关。
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