几种与神经可塑性有关的分子在出生后小鼠和鸣禽脑内的动态表达

论文摘要

collapsin response mediator protein-4 （CRMP-4）是CRMP家族的一个成员,这个家族的许多成员是参与神经元分化和突触重组调控的重要分子。已知鸣禽的许多脑区具有高度神经可塑性。为了揭示CRMP-4在鸣禽脑内可能具有的潜在功能,我们通过RT-PCR和3’ rapid amplification of cDNA ends （3’RACE）的分子生物学方法,首次从鸣禽-白腰文鸟（Lonchura striata）的大脑中获得了CRMP-4 cDNA的部分序列,然后检验了CRMP-4 mRNA和蛋白在成年鸣禽几个具有可塑性的脑区的表达。应用双重免疫组织化学标记的方法,对表达CRMP-4的细胞的表型进行了鉴定。应用双重免疫标记的内容包括:未成熟的神经元（anti-HuD）,成熟神经元（anti-NeuN或者α-tubulin）,星型胶质细胞（anti-GFAP）,轴突生长发育阶段的特异标记分子（anti-GAP-43, growth associated protein 43）,以及增殖细胞的标记物（anti-BrdU,5’-bromodeoxyuridine）。在本项实验中,获得的主要结果是:（1）克隆了CRMP-4 cDNA的2个片段（502bp, 798bp）,说明CRMP-4 mRNA存在于白腰文鸟的脑内。并且这两个片段都与已经报道的相关的CRMP-4有高度同源,说明CRMP-4具有进化上的保守性;（2）分别通过使用原位杂交和免疫组织化学方法,发现CRMP-4 mRNA和蛋白在鸣禽的发声控制区域和小脑中都有表达,CRMP-4蛋白还出现在相当长的投射纤维的通路上;（3）一些CRMP-4阳性的细胞也表达HuD抗体,但是不被NeuN,α-tubulin, GFAP, GAP-43和BrdU标记;有丝分裂的标记物BrdU并没有在鸣禽脑内CRMP-4阳性的细胞中表达。通过结果可以推论出:CRMP-4在不同物种的脑中可能发挥相似的作用。CRMP-4存在的脑区表现出神经可塑性,说明CRMP-4在鸣禽脑内的突触重组过程发挥了重要的作用。CRMP-4主要出现在展示了成年动物中轴突生长和/或突触重组的区域。这说明CRMP-4可能是持续的突触发生或者散在的纤维替代的标志物,伴随着神经元的重新转变。CRMP-4蛋白不仅在轴突生长中表达,也在一些其他的“可塑性”事件中表达。CRMP-4可能通过HuD,α-tubulin或GAP-43的共同合作来参与神经可塑性。并且CRMP-4阳性的细胞并不是新产生的。Collapsin response mediator protein-4 （CRMP-4）是CRMP家族的一个成员,可能参与了神经元的分化和突触重组的调控。已知鸣禽脑中发声学习及听觉的脑区具有神经可塑性。为揭示鸣禽脑区神经可塑性调控的分子机制,在本实验中我们应用免疫组织化学方法研究了CRMP-4在鸣禽——白腰文鸟（Lonchura striata）脑出生后发育过程中的动态变化。本文重点检测了涉及发声学习及听觉系统的一些脑区。控制发声学习的脑区包括HVC、RA、LMAN、DLM和NCM;听觉核团主要包括OV、MLd和NM。结果发现,CRMP-4蛋白在鸣唱控制核团（HVC, RA, LMAN, DLM和NCM）与听觉核团（OV, MLd和NM）中都有表达。在本项实验中,我们的结论是:在白腰文鸟出生后,从幼年到成年的发育过程中,（1）通过使用免疫组织化学方法,发现CRMP-4蛋白在鸣唱控制核团（HVC、RA、LMAN、DLM和NCM）与听觉核团（OV、MLd和NM）中都有表达;（2）CRMP-4蛋白在这些核团内的标记密度从出生后开始逐渐下降,且标记细胞的形态也发生变化,从呈椭圆形且有较小突起的细胞,转变为呈不规则形状且有不同类型突起的多种形态的细胞。结果提示,CRMP-4表达的脑区具有较大的神经可塑性,与CRMP-4表达相关的这种可塑性随着鸣禽年龄的增加而逐渐下降。CRMP-4在鸣禽脑内的突触重组过程可能发挥重要的作用。Collapsin-1,GAP-43,Neuropilin-1,Netrin-1和Neurofilament,这些成员参与了神经元的分化和突触重组的调控。GAP-43在神经元中的表达与发育和成年期间轴突的延伸、突触发生和神经的大量生长紧密相关,是可塑性有关的因子。Collapsin-1在发育和成熟的神经系统中有大量的功能。它已经显示出在新皮层神经元迁移和退化中发挥了作用。Collapsin-1还可能在成年中枢神经系统的伤疤的形成、发生颉抗和轴突退化的抑制中发挥作用。Col1apsin-1不仅调控了轴突的路径寻找以及神经前体细胞的迁移,还参与了细胞的迁移和组织转移。这表明更为寻常的效果是在细胞骨架而不是轴突的生长锥上。Col1apsin-1信号受到一个包括Neuropilin-1的受体复合物的调节。Neuropilin家族的蛋白在多种分子间的反应中发挥作用,表现出多种多样的分子功能。引导分子的浓度梯度和神经营养因子直接诱导当地的生长锥和它们的轴突的变化。Neuropilin-1阳性的神经突起分布在生长锥上。引导分子的浓度梯度和神经营养因子直接诱导当地的生长锥和它们的轴突的变化。Netrin-1在本地诱导生新的轴突生长,并促进当地的轴突的分支。Neurofilament在建立和维持神经元的形状中起到主导作用,包括复杂的树突长成树枝状的过程和轴突长成树干状的过程。哺乳动物的海马已知是具有神经可塑性的区域。尤其是海马齿状回不仅由于组织结构的简明性使其成为一个研究上受人青睐的系统,还在于终止于齿状回的颗粒细胞胞体或树突的不同组成成分的外在的传入神经纤维和一些联系通路可以分析参与这些联系中发育的因子,使得海马齿状回比大部分其他的皮层区域更容易成为一个控制的任务。为了揭示在哺乳动物海马内可能具有的潜在功能,我们第一次比较了在哺乳动物-小鼠海马内,Collapsin-1,GAP-43,Neuropilin-1,Netrin-1和Neurofilament五种蛋白在出生后发育过程中的动态变化。研究这些蛋白的表达模式有助于了解神经可塑性的时空变化。但是有关海马的研究主要集中在细胞和分子水平,而且没有关于这些基因相互之间随着哺乳动物海马发育的表达关系。本实验利用免疫组织化学和双重标记等技术对这五个与轴突生长相关的基因在小鼠出生后海马发育过程中蛋白水平的时空分布做了较为细致的研究。本研究证实（1）从幼年到成年GAP-43蛋白信号的分布有很大的差异,P3稀疏地分布于海马各亚区;P5-8主要位于齿状回内并高表达;P10-30颗粒细胞层和锥体细胞层几乎无分布,而是集中在始层、辐射层和分子层的纤维网状结构内。但在成年海马中的每一亚区中又有中度的表达。幼年海马齿状回内的高表达说明神经联系大部分在出生后建立,其他亚区仍然有少量的出生后联系的建立。GAP-43存在于成熟的神经系统中被认为表明了这些区域是依赖于感觉或者学习认知的可塑性重塑区域。（2）Collapsin-1,Neuropilin-1和Netrin-1标记的细胞几乎遍布海马各亚区的细胞层中,通过双重组织标记发现这些蛋白相互之间定位于同样的细胞中。Collapsin-1、Neuropilin-1和Netrin-1在小鼠海马中的表达可能有助于清除出生后大量的异常的神经联系,并维持正常海马内业已建立或正在建立的联系,从而到达神经系统的高效性,避免冗余和错误建设。（3）Neurofilament标记纤维投射,并随着年龄增加而逐渐减少,可见神经投射主要建立于出生后早期,但此后一直到成年仍然有部分投射的建立或维持。（4）GAP-43与Collapsin-1或Neurofilament都有双重标记,说明正在建立突触联系的细胞仍然要拒绝一些错误的神经联系,并且本身细胞内部的骨架也在发生着动态变化。海马细胞在发育过程中存在不同来源神经投射的相互竞争,研究Collapsin-1,GAP-43,Neuropilin-1,Netrin-1和Neurofilament在它们出生后发育过程中的表达情况有助于揭示神经发生和投射竞争的作用模式,说明小鼠海马内存在的脑区表现出神经可塑性,为从分子水平阐明其产生机制提供基础,并为其他脑区的发育和可塑性研究提供优良的模型。Collapsin-1,GAP-43,Neuropilin-1,Netrin-1和Neurofilament,这些成员参与了神经元的分化和突触重组的调控。哺乳动物的小脑已知是具有神经可塑性的区域。研究这些蛋白的表达模式有助于了解哺乳动物脑内神经可塑性的时空变化。但是有关小脑皮层Purkinje细胞的研究主要集中在细胞和分子水平的研究。为了揭示在哺乳动物小脑内可能具有的潜在功能,本实验利用免疫组织化学和双重标记等技术第一次比较了在哺乳动物-小鼠小脑内Collapsin-1,GAP-43,Neuropilin-1,Netrin-1和Neurofilament五个与轴突生长紧密相关的基因在小鼠小脑皮层出生后发育过程中的动态变化。GAP-43在神经元中的表达与发育和成年期间轴突的延伸、突触发生和神经的大量生长紧密相关。Collapsin-1不仅调控了轴突的路径寻找以及神经前体细胞的迁移,还参与了细胞的迁移和组织转移。这表明的更为寻常的效果是在细胞骨架而不是轴突的生长锥上。Col1apsin-1信号受到一个包括Neuropilin-1的受体复合物的调节。Neuropilin家族的蛋白在多种分子间的反应中发挥作用,表现出多种多样的分子功能。引导分子的浓度梯度和神经营养因子直接诱导当地的生长锥和它们的轴突的变化。引导分子的浓度梯度和神经营养因子直接诱导当地的生长锥和它们的轴突的变化。Netrin-1在本地诱导生新的轴突生长,并促进当地的轴突的分支。Neurofilament在建立和维持神经元的形状中起到主导作用。本研究证实（1）从幼年到成年GAP-43蛋白信号的分布有较大的差异,P3-8分布于外颗粒细胞层、Purkinje细胞层和内颗粒细胞层;P10-90以点状形式只分布于分子层中。说明幼年小脑内的高表达说明神经联系大部分在出生后两星期内建立,但之后仍然有少量的联系建立。（2）Collapsin-1,Neuropilin-1和Netrin-1标记的细胞几乎遍布小脑的Purkinje细胞层,通过双重组织标记发现这些蛋白相互之间定位于同样的细胞中。Collapsin-1、Neuropilin-1和Netrin-1在小鼠小脑中的表达可能有助于清除出生后大量的异常的神经联系,并维持正常小脑内业已建立或正在建立的联系,从而到达神经系统的高效性,避免冗余和错误建设。（3）Neurofilament标记纤维投射随着年龄增加而逐渐减少,可见神经投射主要建立于出生后早期,但此后一直到成年仍然有部分投射的建立或维持,并且本身细胞内部的骨架也在发生着动态变化。小脑皮层Purkinje细胞在发育过程中均要接受来自两种以上其他核团的神经投射,在发育过程中存在不同来源神经投射的相互竞争,研究它们在它们出生后发育过程中的表达情况有助于揭示神经发生和投射竞争的作用模式,为从分子水平阐明其产生机制提供基础,并为其他脑区的发育和可塑性研究提供优良的模型。

论文目录

• 缩略词表
• 第一章 COLLAPSIN RESPONSE MEDIATOR PROTEIN-4 （CRMP-4）在成年鸣禽脑内可塑性脑区的表达
• 摘要
• ABSTRACT
• 综述 COLLAPSIN RESPONSE MEDIATOR PROTEIN-4 （CRMP-4）功能和成年鸣禽脑的可塑性
• 前言
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 第二章 CRMP-4 蛋白在鸣禽脑内的动态表达及定位
• 摘要
• ABSTRACT
• 综述 鸣禽脑的神经可塑性变化与神经发生
• 1. 鸣禽脑的神经可塑性变化
• 2.鸣禽脑内的神经发生
• 前言
• 结果
• 1. Western 杂交
• 2. 鸣唱控制核团（HVC, RA, LMAN, DLM 和 NCM）与听觉核团（OV,MLD 和 NM）发育过程中CRMP-4 的动态表达
• 3. 幼年和成年鸣禽大脑多个核团内 CRMP-4 探针原位杂交标记的对比
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第三章 轴突可塑性相关蛋白在出生后小鼠海马中的动态表达
• 摘要
• ABSTRACT
• 综述 COLLAPSIN-1，GAP-43，NEUROPILIN-1，NETRIN-1 和NEUROFILAMENT共同参与神经发育的调节以及小鼠海马的结构、发育和神经发生的特点
• 1. 引言
• 1.1 神经突触生长的标志分子：GAP-43
• 1.2 神经突生长的排斥分子：collapsin-1 的功能
• 1.3 神经突生长的排斥分子collapsin-1 的受体 Neuropilin-1 的功能
• 1.4 神经突生长的调控分子：Netrin-1 促进还是抑制轴突的生长？.
• 1.5 细胞骨架的维持者之一：Neurofilament
• 2. 研究哺乳类海马的意义
• 3. 哺乳类海马的结构
• 4. 大鼠海马齿状回颗粒细胞起源的时间和迁移模式
• 5. 海马齿状回的组织结构学发育
• 前言
• 结果
• GAP-43、netrin-1、collapsin-1、neuropilin-1 和neurofilament 蛋白在出生后和成年阶段中在海马内的差异表达模式
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第四章 轴突可塑性相关蛋白在出生后小鼠小脑内的动态表达
• 摘要
• ABSTRACT
• 综述 小脑皮层的结构和发育特点以及几个与神经可塑性有关的分子在发育小脑皮层中的表达
• 1. 小脑皮层的组织结构和出生后发育
• 2. 几个与神经可塑性有关的分子在发育小脑皮层中表达的最新研究进展
• 前言
• 结果
• 1. 小脑皮层内 Collapsin-1，GAP-43，Neuropilin-1，Netrin-1 和Neurofilament 免疫组织化学的结果
• 2. 不同分子之间荧光双重标记的结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 致谢