梨火疫病菌群体感应相关基因luxS的功能分析

论文摘要

由梨火疫病菌Erwinia amylovora引起的蔷薇科植物的火疫病是一类毁灭性的细菌病害,造成严重的经济危害。为了有效防治病害的发生及危害,人们对其致病因子的分子机理作了大量的研究。而许多植物病原细菌毒性因子的产生都依赖于群体感应（quorum sensing,QS）系统的调节。LuxS蛋白参与细菌群体感应信号分子autoinducer-2（AI-2）合成的最后一步。本研究在实验室已有的研究基础上构建了Erwinia amylovora strainNCPPB1665（Era NCPPB1665）的luxS突变体（Ea△luxS）并且对突变体的表型进行了初步的分析。研究发现Ea△luxS影响细菌的游动性、胞外多糖的分泌以及对双氧水的耐受能力。分别将Era NCPPB1665、Ea△luxS、功能互补菌株Ea△luxS（pPRO-luxS）和空载体对照Ea△luxS（pPROEXHta）接种梨树叶柄,发现接种突变体Ea△luxS和空载体对照Ea△luxS（pPROEXHta）的叶片发病情况比野生型和功能互补菌株Ea△luxS（pPRO-luxS）明显降低。这表明luxS基因影响Era NCPPB1665重要毒性基因的表达,因此,干扰luxS基因的表达可能能成为控制梨火疫病菌的一种潜在方式。为了进一步明确luxS基因是否影响Era NCPPB1665中hrp基因的表达,我们在E.amylovora Ea321的致病岛中挑选了八个hrp相关基因,分别为dspE、hrpW、hrpA、hrpB、hrcJ、hrpL、hrpJ、hrpY。同时,根据Sanger Institute（www.sanger.ac.uk）网站中公布的E.amylovora基因组序列,对八个相关基因分别设计引物。提取野生型Era.NCPPB1665、突变体Ea△luxS、功能互补菌株Ea△luxS（pPRO-luxS）和空载体对照Ea△luxS（pPROEXHta）的总RNA,利用反转录差异显示技术研究luxS基因对八个hrp相关基因表达的影响情况。研究发现,luxS基因并不影响hrp相关基因的表达。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 第一篇:文献综述
• 第一章 梨火疫病菌
• 1.梨火疫病的历史、危害及生物学
• 1.1 梨火疫病的简史
• 1.2 梨火疫病菌的形态特征及病原生物学
• 1.3 梨火疫病菌的分布
• 1.4 梨火疫病菌的寄主植物
• 1.5 梨火疫病菌的危害情况
• 1.6 梨火疫病菌的传播途径
• 2.梨火疫病菌的检测技术研究进展
• 2.1 传统的检测技术
• 2.2 核酸探针技术
• 2.3 多聚酶链式反应（PCR）技术
• 3.梨火疫病菌的致病因子
• 3.1 E.amylovora的hrp致病岛
• 3.1.1 hrp/dsp基因簇
• 3.1.2 Hrp—相关酶（HAE）区
• 3.1.3 岛转移（IT）区
• 3.2 Hrp T3SS泌出蛋白
• 3.2.1 Harpins、HrpN和HrpW
• 3.2.2 DspA/E
• 3.2.3 EopB
• 3.3 其他蛋白
• 3.4 其他致病性和毒性因子
• 3.4.1 EPS（extracellular polysaccharide）:梨火疫菌素和果聚糖
• 3.4.2 山梨糖醇代谢
• 3.4.3 蛋白酶
• 3.4.4 噬铁素
• 第二章 Quorum-sensing调控系统
• 1.群体感应的定义
• 2.群体感应现象的发现
• 3.几种不同的QS调控系统
• -细菌的群体感应'>3.1 G^-细菌的群体感应
• +细菌的寡肽语言'>3.2 G⁺细菌的寡肽语言
• 3.3 不同种细菌之间的信号交流
• 3.4 细菌的通用语言
• 3.5 细菌与寄主之间的"语言"
• 4.Quorum-sensing系统的生物功能
• 5.细菌群体效应研究的意义及展望
• 5.1 信号干扰机制的种类
• 5.1.1 革兰氏阴性细菌QS信号干扰
• 5.1.2 革兰氏阳性细菌QS信号干扰
• 5.1.3 AI-2群体感应的信号干扰
• 5.1.4 AI-3群体感应的信号干扰
• 5.2 细菌QS信号干扰和寄主的防御
• 5.3 细菌QS信号干扰机制在病害防治中的应用
• 5.3.1 天然QS信号干扰物质的研究及其应用
• 5.3.2 人造QS信号干扰物质的研究及其应用
• 5.4 发展前景
• 第二篇:研究内容 梨火疫病菌（Erwinia amylovora）群体感应相关基因luxS的功能分析
• 第一节 E.amylovora luxS突变体（Ea△luxS）的构建以及突变体表型的初步研究
• 1.材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 培养基
• 1.2.方法
• 1.2.1 E.amylovora菌株Era NCPPB1665基因组DNA的提取
• 1.2.2 大肠杆菌感受态的制备和转化（Samebrook and Russell,2001）
• 1.2.3 无细胞的培养上清（CFMs）的制备以及V.harveyi生物发光检测系统
• 1.2.4 突变体构建
• 1.2.5 V.harveyi生物发光检测突变体生物发光情况
• 1.2.6 功能互补菌株Ea△luxS（pPRO-luxS）的构建及验证
• 1.2.7 luxS基因的突变对一些表型的影响
• 2 结果
• 2.1 Era NCPPB1665的luxS突变体的构建及验证
• 2.1.1 pCAM-MCS-luxSsx-Km自杀载体的构建
• 2.1.2 Era NCPPB1665的luxS突变体的构建
• 2.1.3 Era NCPPB1665的luxS突变体的Southern杂交检测
• 2.1.4 测序验证
• 2.1.5 Era NCPPB1665的luxS突变体产生AI-2的情况
• 2.2 pPRO-luxS表达载体的构建及验证
• 2.2.1 pPRO-luxS表达载体的构建及验证
• 2.2.2 功能互补菌株Ea△luxS（pPRO-luxS）恢复产生AI-2的情况
• 2.3 luxS基因的突变对一些表型的影响
• 2.3.1 luxS突变体不影响Era NCPPB1665对烟草的过敏性反应
• 2.3.3 luxS基因的突变不影响Era NCPPB1665生物膜的生成
• 2.3.4 luxS基因的突变影响Era NCPPB1665的胞外多糖的分泌
• 2O₂的能力'>2.3.5 luxS基因的突变影响Era NCPPB1665耐H₂O₂的能力
• 2.3.6 luxS基因的突变影响Era NCPPB1665的致病性
• 3.讨论
• 第二节 luxS基因调控hrp基因表达的研究
• 1.材料和方法
• 1.1 供试菌株
• 1.2 培养基
• 1.3 Era NCPPB1665和Ea△luxS菌株总RNA的提取
• 1.4 cDNA的合成
• 1.5 hrp相关基因、功能及引物序列
• 1.6 内参基因的选用以及对条件的摸索
• 1.7 RT-PCR扩增反应
• 2.结果
• 2.1 总RNA的提取
• 2.2 内参基因对实验条件的摸索
• 2.3 luxS基因调控hrp基因表达
• 3.讨论
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士期间发表和待发表的论文
• 致谢