RNAi技术干扰骨肉瘤细胞Dll4表达抑制侵袭转移和血管生成的体内外实验研究

论文摘要

目的:探讨Dll4在骨肉瘤组织的表达及意义;靶向沉默Dll4的表达对骨肉瘤侵袭转移和血管生成的作用机制。方法:（1）采用免疫组化的方法检测62例骨肉瘤组织中Dll4蛋白的表达,结合临床病理资料分析,研究Dll4的表达与临床病理特征的关系。（2）构建全长的逆转录病毒pSUPER-Dll4-siRNA质粒,通过鉴定后,将其稳定转染到PT67细胞培养,获得分泌Dll4蛋白病毒血清,干预沉默人骨肉瘤细胞株SOSP-9607E10中Dll4的表达;干预沉默人微血管内皮细胞系（HMEC-1）,体外采用划痕实验、Transwell侵袭实验、血管成管实验、MTT和流式细胞仪检测等方法,研究Dll4调控骨肉瘤细胞分化增殖、骨肉瘤侵袭运动和骨肉瘤血管成管的分子机制验证Dll4调控骨肉瘤血管成管的分子机制导致肿瘤生物学行为的改变。结果:（1）Notch1、Dll4在骨肉瘤和骨软骨瘤中的表达Notch1蛋白的阳性表达主要在肿瘤细胞的细胞质或细胞膜,呈棕黄色,散在分布。62例骨肉瘤中有53例呈阳性表达,阳性率为85.5%（53/62）,对照组为21.2%（9/43）,两组差异具有显著性（P＜0.05）。Dll4蛋白的阳性表达主要在肿瘤细胞的细胞质或细胞膜,部分表达在血管内皮细胞。62例骨肉瘤中有55例呈阳性表达,阳性率为88.7%（54/62）,对照组为23.6%（10/43）,两者之间差别具有显著性（P＜0.05）,Notch1和Dll4在骨肉瘤中的表达高于在骨软骨瘤中的表达,提示Notch1和Dll4可能参与了骨肉瘤的发生、发展。（2）.Notch1、Dll4表达及其与骨肉瘤病理临床指标的关系Notch1与Dll4在骨肉瘤中表达存在正相关关系,相关系数rs为0.842,P=0.027。Notch1及Dll4蛋白表达与骨肉瘤组织分化程度、Ennecking分期和有无转移密切相关（P＜0.05）,但与肿瘤直径、性别、年龄、ALP（碱性磷酸酶）无关（P＞0.05）。（3）骨肉瘤中Notch1和Dll4表达与MVD表达的关系Notch1高表达组MVD为35.2±9.3,显著高于低表达组28.3±3.4,此外,Dll4高表达组MVD为36.2±7.2,显著高于低表达组29.5±2.2,差别具有显著性（P＜0.05）。骨肉瘤中Notch1和Dll4表达与MVD表达的具有相关性（P＜0.05）,Notch1及Dll4蛋白高表达可能在骨肉瘤血管生成进程中起重要作用。（4）Dll4的表达与骨肉瘤的侵袭转移潜能密切相关Dll4 mRNA和蛋白在SOSP-9607H9及SOSP-9607E10两株细胞中的表达。结果显示:在SOSP-9607H9及SOSP-9607E10两个骨肉瘤细胞株细胞中,Dll4 mRNA和蛋白表达水平分别0.43±0.11 vs0.86±0.09、0.47±0.05vs 0.82±0.08,具有显著性差异（P＜0.05）。（5）逆转录病毒介导的小RNA干扰特异性沉默SOSP-9607E10癌细胞系中Dll4的表达SOSP-9607E10Dll4RNAi+中Dll4的表达被明显抑制,较对照组而言,其抑制效率超过70%（P＜0.05）,而作为对照的SOSP-9607E10Dll4RNAi-中Dll4的表达较SOSP-9607E10细胞系无明显变化。以上结果提示本研究中采用逆转录病毒介导的小RNA干扰能够有效特异的沉默SOSP-9607E10骨肉瘤细胞中Dll4的表达。（6）体外实验中抑制Dll4的表达可以抑制骨肉瘤细胞的侵袭迁移而不影响其增殖和凋亡SOSP-9607E10Dll4RNAi+较SOSP-9607E10Dll4RNAi-细胞迁移能力明显下降,24小时划痕愈合率分别为62%vs 77%,差异具有显著性意义（P＜0.05）。采用Transwell侵袭小室测定法比较SOSP-9607E10Dll4RNAi+和SOSP-9607E10Dll4RNAi-的侵袭能力,结果显示SOSP-9607E10Dll4RNAi+和SOSP-9607E10Dll4RNAi-细胞侵袭能力明显下降,24小时培养后穿过Transwell的每低倍视野细胞数分别为63±11 vs129±13,差异具有显著性意义（P＜0.05）。用MTT法比较SOSP-9607E10Dll4RNAi+和SOSP-9607E10Dll4RNAi-的增殖能力,差异不具有显著性意义（P＞0.05）。检测SOSP-9607E10Dll4RNAi+和SOSP-9607E10Dll4RNAi-的凋亡情况,两组细胞差异不具有显著性意义（P＞0.05）。（7）体内抑制Dll4的表达可以抑制骨肉瘤细胞的成瘤能力比较MiceDll4RNAi+和MiceDll4RNAi-两组裸鼠模型中SOSP-9607E10原发瘤的大小,结果显示皮下种植45天后SOSP-9607E10原发瘤的大小（cm3）分别为3.01±0.22和3.45±0.23,差异具有显著性意义（P＜0.05）,比较MiceDll4RNAi+和MiceDll4RNAi-两组裸鼠模型SOSP-9607E10原发瘤中的MVD,结果显示MiceDll4RNAi+和MiceDll4RNAi-两组裸鼠模型SOSP-9607E10原发瘤中每高倍镜视野平均MVD值分别为29±2和37±3,差异具有显著性意义（P＜0.05）。（8）体外实验中抑制Dll4的表达可以抑制HMEC-1人微血管内皮细胞的侵袭迁移而不影响其增殖和凋亡实验组HMEC-1Dll4RNAi+较对照组HMEC-1Dll4RNAi-细胞迁移能力明显下降,24小时划痕愈合率分别为69%vs 92%,差异具有显著性意义（P＜0.05）。细胞侵袭能力也明显下降,24小时培养后穿过Transwell的每低倍视野细胞数分别为49±6 vs 70±3,差异具有显著性意义（P＜0.05）。MTT法比较HMEC-1Dll4RNAi+较对照组HMEC-1Dll4RNAi-的增殖能力,差异不具有显著性意义（P＞0.05）。两组细胞的凋亡差异不具有显著性意义（P＞0.05）。（9）体外实验中抑制Dll4的表达可以抑制HMEC-1人微血管内皮细胞的血管生成HMEC-1Dll4RNAi+组不能成管;对照组成管指数为2397±726,实验组成管指数为489±215,两组差异具有显著性意义（P＜0.05）。三维血管新生模型对照组和实验组中每10个微载体成管数分别为45±9和9±7,差异具有显著性意义（P＜0.05）,这些结果说明体外抑制Dll4的表达可以抑制HMEC-1人微血管内皮细胞的血管生成。（10）体内实验中抑制Dll4的表达可以抑制VEGF诱导的血管生成实验组Matrigel中的新生血管少于对照组,实验组和对照组Matrigel中新生血管总长度分别为23634±6421μm和32145±4314μm,差异具有显著性意义（P＜0.05）这说明体内实验中抑制的Dll4表达可以抑制VEGF诱导的新生血管生成。结论:Dll4在骨肉瘤中的高表达可能参与了骨肉瘤的发生发展,Dll4可能作为预测骨肉瘤不良预后的肿瘤标志物;Dll4可能通过调控血管成管分子机制参与了骨肉瘤的侵袭转移;Dll4可能成为抗骨肉瘤侵袭转移和血管生成的基因治疗新靶点。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 中英文缩略语对照
• 前言
• 第一部分 DLL4在骨肉瘤组织中的表达及临床意义
• 引言
• 1.材料和方法
• 1.1 组织标本和临床病理资料收集
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 方法
• 2.结果
• 2.1 Notch1、Dll4在骨肉瘤和骨软骨瘤中的表达
• 2.2 Notch1、Dll4表达及其与骨肉瘤病理临床指标的关系
• 2.3 骨肉瘤中NOTCH1和DLL4表达与MVD表达的关系
• 3 讨论
• 3.1 Dll4、Notch1表达与骨肉瘤
• 3.2 Dll4-Notch1信号通路和骨肉瘤血管生成的机制
• 3.3 Dll4-Notch1信号通路在骨肉瘤血管生成中的意义
• 小结
• 第二部分 RNAI干扰DLL4对骨肉瘤细胞肿瘤生物学行为影响的体内外研究
• 引言
• 1.材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2.结果
• 2.1 逆转录病毒介导的小RNA干扰特异性质粒的鉴定
• 2.2 Dll4在不同转移侵袭潜能的骨肉瘤中的差异表达
• 2.3 逆转录病毒介导的小RNA干扰特异性沉默SOSP-9607E10癌细胞系中Dll4的表达
• 2.4 体外实验中抑制Dll4的表达可以抑制骨肉瘤细胞的侵袭迁移而不影响其增殖和凋亡
• 2.5 体内抑制Dll4的表达可以抑制骨肉瘤细胞的成瘤能力
• 3.讨论
• 3.1 逆转录病毒介导的SiRNA干扰SOSP-9607E10细胞中Dll4表达抑制骨肉瘤细胞侵袭能力
• 3.2 逆转录病毒介导的SiRNA干扰以及SOSP-9607E10细胞裸鼠成瘤模型的改进
• 小结
• 第三部分 DLL4调控骨肉瘤新生血管生成的体内外研究
• 引言
• 1.材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2.结果
• 2.1 逆转录病毒介导的小RNA干扰特异性沉默HMEC-1人微血管内皮细胞系中Dll4的表达
• 2.2 体外实验中抑制Dll4的表达可以抑制HMEC-1人微血管内皮细胞的侵袭迁移而不影响其增殖和凋亡
• 2.3 体外实验中抑制Dll4的表达可以抑制HMEC-1人微血管内皮细胞的血管生成
• 2.4 体内实验中抑制Dll4的表达可以抑制VEGF诱导的血管生成
• 3.讨论
• 小结
• 结论
• 参考文献
• 综述（一）
• 综述（二）
• 致谢
• 攻读博士期间主要研究成果