猪IFN-γ及其受体的生物学功能研究

论文摘要

IFN-γ是由机体内活化的T淋巴细胞和NK细胞产生的一种糖蛋白,丝裂原以及抗原特异性刺激的T细胞克隆也可产生和分泌。IFN-γ除具有抗病毒、抗胞内寄生菌、抗胞内寄生原虫、抗细胞增殖的作用外,还具有独特而强大的免疫调节功能,可促进MHCⅡ类抗原的表达,增强APC与T细胞的相互作用,增强Th细胞和CTL转化的能力等。IFN-γ有较为严格的种属特异性,不同物种之间通用使其活性降低或失去作用。IFN-γ活性形式为两条单体链结合形成的同型二聚体形式,单体没有生物学活性。IFN-γ作为机体免疫应答的产物,一方面是机体发挥免疫功能,清除胞内寄生病原体不可缺少的成分,与疾病的发生、发展有着密切的关系;另一方面,机体内IFN-γ分泌过量,可引起病理性反应。由于IFN-γ具有上述诸多重要的生物学活性,故其在疾病的诊断、治疗和预防等方面具有广阔的应用前景。但是,IFN-γ在临床应用时可引起发热、寒战、恶心等一系列的副作用,而且有些不良反应是不可逆的损害,这限制了其在临床中的应用。因此,开展新型、低毒副作用的pIFN-γ研究意义重大。此外,IFN-γ必须与受体相结合,通过受体的介导才能发挥其生物学效应,对其受体的研究将有利于明确IFN-γ的作用机制,进而发现疾病治疗和预防的新途径。本论文在对克隆的pIFN-γ基因进行适当的改造,去除其信号肽序列,将该基因与pGEX-4T-1载体上的谷胱甘肽S-转移酶（GST）拼接,然后在原核表达系统中进行表达,并对其诱导表达条件、蛋白纯化方法进行系统研究,最终获得了纯度高达95%的GST-pIFN-γ融合蛋白,产量为0.40.5g/L培养液。体外试验证实该重组蛋白具有较高的生物活性,可有效抑制PRV（DNA病毒）和FMDV（RNA病毒）的复制,并且具有稳定、不宜降解和低毒副作用的优点。开展了重组pIFN-γ体外抗弓形虫研究,结果表明pIFN-γ可诱导猪腹腔巨噬细胞产生抗虫作用,且随pIFN-γ量的增加抗弓形虫作用越明显,但任何浓度的重组pIFN-γ对弓形虫入侵PK15细胞无明显影响。对pIFN-γ诱导永生化细胞（PK15细胞）凋亡的作用及其对细胞端粒酶的影响进行了研究,结果发现在高浓度pIFN-γ的长时间诱导下,PK15细胞端粒酶显著下降,因此PK15细胞（肿瘤样细胞）发生凋亡,具体表现为细胞变圆脱落,DNA出现典型的“梯状带”,荧光染色可发现细胞核固缩,有凋亡小体出现;但如果用低浓度pIFN-γ进行诱导作用,PK15细胞端粒酶明显升高;该研究结果为IFN-γ临床治疗肿瘤提供了理论依据和指导。以表达纯化的GST-pIFN-γ作为抗原免疫BALB/C小鼠,取其脾细胞和SP2/0细胞融合,再经纯化的GST-pIFN-γ和的带组氨酸标签pIFN-γ作为包被抗原进行筛选,最终获得2株分泌pIFN-γ单抗的杂交瘤细胞株,经鉴定这两株单抗抗体亚类均属于IgG2a,轻链为κ型,对杂交瘤细胞株的染色体组型、单抗的稳定性及其识别的抗原位点等进行分析,结果证明所获2株单抗均表现稳定,可满足常规实验的要求。在对不同动物IFNGR两条链基因序列比对基础上,选择保守区段作为引物;然后分离猪外周血淋巴细胞,经刺激后提取细胞总RNA,应用RT-PCR方法克隆了猪IFNGR两条链基因,序列测定表明猪IFNGR1基因ORF为1413bp,共编码470个氨基酸;猪IFNGR2基因ORF为1110bp,共编码369个氨基酸。对不同物种IFNGR序列比较发现,不同物种间的差异比较大,据此推测这可能是IFN-γ种属特异性的重要原因之一。然后利用分子生物学软件对两条链进行结构预测,设计引物扩增猪IFNGR胞外区片段并对其进行原核表达,经鉴定该基因在原核中得到正确表达;开展了两条受体链胞外区对pIFN-γ抗病毒活性的影响研究,发现猪IFNGR1胞外区可降低pIFN-γ抗病毒活性,而IFNGR2胞外区可增强pIFN-γ抗病毒活性,由此可知猪IFNGR两条链均可结合pIFN-γ;此外,推测猪IFNGR1具有信号转导功能且是IFN-γ信号转导的主要执行者,而IFNGR2则在IFN-γ信号转导中起次要作用或没有信号转导的能力。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩略表
• 第一章 绪论
• 1.1 IFN-γ研究进展
• 1.1.1 IFN-γ的分子结构和编码基因
• 1.1.2 IFN-γ的诱生
• 1.1.3 重组IFN-γ的研究
• 1.1.4 IFN-γ基因的转录调控
• 1.1.5 IFN-γ的生物学活性及其作用机制
• 1.1.6 IFN-γ的检测方法研究
• 1.1.7 IFN-γ应用研究及前景
• 1.2 IFN-γ受体及其介导的信号转导研究进展
• 1.2.1 IFNGR的结构特点
• 1.2.2 IFNGR介导的信号转导
• 1.2.3 IFN-γ信号通路的负反馈调控
• 第二章 猪IFN-γ融合表达和纯化
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验菌种和载体
• 2.1.2 酶和试剂
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 溶液
• 2.1.5 仪器与设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 表达载体的构建
• 2.2.2 重组菌的诱导表达及表达条件的优化
• 2.2.3 GST-pIFN-γ高效表达产物的纯化
• 2.2.4 纯化GST-pIFN-γ蛋白分析
• 2.3 结果
• 2.3.1 原核表达载体的构建及鉴定
• 2.3.2 GST-pIFN-γ融合蛋白诱导表达条件的优化
• 2.3.3 GST-pIFN-γ的高效表达及纯化
• 2.3.4 纯化GST-pIFN-γ蛋白含量及产量测定
• 2.3.5 表达产物Western-blot分析
• 2.4 分析讨论
• 第三章 重组GST-pIFN-γ融合蛋白抗病毒活性及其理化特性研究
• 3.1 材料
• 3.1.1 实验动物、细胞及病毒株
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 溶液
• 3.1.4 仪器与设备
• 3.2 方法
• 3.2.1 PK15 细胞的培养
• 3.2.2 病毒毒价测定
• 3.2.3 重组GST-pIFN-γ融合蛋白抗病毒活性分析
• 3.2.4 GST-pIFN-γ稳定性研究
• 3.2.5 机体毒副反应性研究
• 3.3 结果
• 3.3.1 PRV和标准O型FMDV毒价测定
• 3.3.2 GST-pIFN-γ抗病毒活性测定
• 3.3.3 GST-pIFN-γ稳定性研究
• 3.3.4 机体毒副反应性研究
• 3.4 分析讨论
• 第四章 带His标签猪IFN-γ的表达、纯化及活性分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果
• 4.2.1 原核表达载体的构建及鉴定
• 4.2.2 重组pIFN-γ诱导表达条件的优化
• 4.2.3 重组pIFN-γ的纯化
• 4.2.4 纯化重组pIFN-γ的含量及产量测定
• 4.2.5 表达产物的Western-blot分析
• 4.2.6 重组pIFN-γ的活性分析
• 4.3 分析与讨论
• 第五章 重组猪IFN-γ体外抗弓形虫作用的研究
• 5.1 材料
• 5.1.1 试剂
• 5.1.2 虫株、细胞和实验动物
• 5.2 方法
• 5.2.1 细胞培养
• 5.2.2 弓形虫悬液制备
• 5.2.3 培养细胞弓形虫攻虫剂量的测定
• 5.2.4 重组猪IFN-γ诱导培养细胞抗弓形虫试验
• 5.3 结果
• 5.3.1 弓形虫致细胞病变的观察
• 5.3.2 弓形虫攻虫剂量的确定
• 5.3.3 重组猪IFN-γ诱导细胞抗弓形虫结果
• 5.4 分析与讨论
• 第六章 猪IFN-γ诱导PK15 细胞凋亡及其作用机制研究
• 6.1 材料
• 6.1.1 细胞及试剂
• 6.1.2 溶液
• 6.1.3 仪器与设备
• 6.2 方法
• 6.2.1 PK15 细胞培养
• 6.2.2 GST-pIFN-γ诱导及细胞收集
• 6.2.3 凋亡DNA Ladder提取与电泳分析
• 6.2.4 Hoechst 33258 荧光染色检测
• 6.2.5 AO/EB荧光染色检测
• 6.2.6 pIFN-γ对PK细胞端粒酶活性影响检测
• 6.3 结果
• 6.3.1 诱导细胞形态的观察
• 6.3.2 诱导细胞DNA电泳分析
• 6.3.3 Hoechest染色检测PK15 细胞凋亡
• 6.3.4 AO/EB荧光染色检测PK15 细胞凋亡
• 6.3.5 pIFN-γ对PK细胞端粒酶活性影响检测结果
• 6.4 分析与讨论
• 第七章 猪IFN-γ单克隆抗体的研制及鉴定
• 7.1 材料
• 7.1.1 抗原、细胞系及实验动物
• 7.1.2 试剂及耗材
• 7.1.3 溶液及培养基
• 7.1.4 仪器与设备
• 7.2 方法
• 7.2.1 间接ELISA法最佳抗原包被量及阳性血清最佳稀释度的确定
• 7.2.2 动物免疫
• 7.2.3 细胞融合
• 7.2.4 阳性杂交瘤细胞的筛选
• 7.2.5 阳性杂交瘤细胞的克隆化、冻存和复苏
• 7.2.6 单克隆抗体腹水的制备
• 7.2.7 杂交瘤细胞及单克隆抗体特性的鉴定
• 7.3 结果
• 7.3.1 间接ELISA法最佳抗原包被量及阳性血清稀释滴度的确定
• 7.3.2 第三次免疫后BALB/c小鼠血清ELISA检测结果
• 7.3.3 亚克隆和单克隆细胞株ELISA检测结果
• 7.3.4 杂交瘤细胞及单抗特性鉴定
• 7.3.5 单抗识别抗原表位分析
• 7.4 分析讨论
• 7.4.1 抗原
• 7.4.2 动物选择和免疫
• 7.4.3 饲养细胞的制备
• 7.4.4 瘤细胞和融合
• 7.4.5 杂交瘤抗体的检测
• 7.4.6 克隆化
• 7.4.7 单克隆抗体亚类
• 7.4.8 杂交瘤细胞的染色体
• 7.4.9 单抗的稳定性实验
• 7.4.10 pIFN-γ单抗的应用
• 第八章 猪IFN-γ受体基因克隆、表达及功能研究
• 8.1 材料
• 8.1.1 试验动物、菌种和载体
• 8.1.2 酶和试剂
• 8.1.3 培养基
• 8.1.4 溶液
• 8.2 方法
• 8.2.1 淋巴细胞的分离与培养
• 8.2.2 淋巴细胞的刺激诱导
• 8.2.3 总RNA的提取
• 8.2.4 引物的设计与合成
• 8.2.5 RT-PCR扩增目的基因
• 8.2.6 目的基因的克隆
• 8.2.7 重组质粒的提取与鉴定
• 8.2.8 猪IFNGR基因序列及其编码蛋白的结构预测
• 8.2.9 猪IFNGR基因表达引物的设计及扩增
• 8.2.10 猪IFNGR表达载体构建及鉴定
• 8.2.11 猪IFNGR胞外区的诱导表达及SDS－PAGE分析
• 8.2.12 重组猪IFNGR表达产物的纯化
• 8.2.13 纯化表达产物的检测
• 8.2.14 猪IFNGR1 与IFNGR2 胞外区对pIFN-γ抗病毒效应的影响
• 8.3 结果
• 8.3.1 RNA提取结果
• 8.3.2 RT-PCR产物
• 8.3.3 重组克隆载体的鉴定
• 8.3.4 猪IFNGR1 和IFNGR2 序列测定及分析
• 8.3.5 原核表达载体的构建及鉴定
• 8.3.6 猪IFNGR1 和IFNGR2 胞外区重组蛋白诱导表达
• 8.3.7 猪IFNGR1 和IFNGR2 胞外区重组蛋白的纯化
• 8.3.8 纯化重组蛋白含量测定
• 8.3.9 纯化重组蛋白Western-blot分析
• 8.3.10 猪IFNGR1 和IFNGR2 胞外区对pIFN-γ抗病毒效应的影响
• 8.4 分析讨论
• 第九章 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历