柚苷酶发酵放大技术及酶制剂的研究

论文摘要

柚苷酶是一种由α-L-鼠李糖苷酶（EC 3.2.1.40）和β-D-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.21）组成的,以水解柚皮苷至柚皮素为特征的糖苷水解复合酶,它在柑橘类果汁的脱苦、饮料增香、黄酮类物质和鼠李糖的工业制备等方面具有重要的应用价值。然而由于柚苷酶发酵生产技术的不成熟和制剂化工艺的缺乏,导致成品柚苷酶酶制剂价格高昂,这严重限制了柚苷酶应用技术的开发,因此建立成熟的柚苷酶规模化发酵技术和合理的制剂化工艺具有重要意义。本论文以黑曲霉DB056为柚苷酶产生菌,在研究了柚苷酶发酵放大之后,进行了柚苷酶制剂化工艺的探索和优化,最后对得到的柚苷酶酶制剂进行了食品安全性检测及储藏稳定性的探讨,主要实验结果如下:柚苷酶7 L、20 L和200 L规模的逐级发酵放大研究表明,随着发酵规模的扩大,柚苷酶的两种组分:α-L-鼠李糖苷酶与β-D-葡萄糖苷酶的酶活力水平会有一定的波动,但酶活力变化趋势基本一致;在200 L规模的发酵中,α-L-鼠李糖苷酶与β-D-葡萄糖苷酶的最高酶活力分别为1069 U/mL和727 U/mL,超过了7 L和20 L规模发酵过程中柚苷酶的活力水平。实验成功实现了黑曲霉DB056产柚苷酶200 L规模的发酵放大,显示了该菌株良好的发酵性能和工业应用价值。柚苷酶发酵液经冷冻离心、除菌过滤、超滤浓缩及喷雾干燥工艺之后便可得到柚苷酶固体酶制剂。柚苷酶浓缩发酵液喷雾干燥中选择麦芽糊精为助干剂,固形物含量为27%,以α-L-鼠李糖苷酶回收率为标准,在单因素实验的基础上,采用响应面分析法对喷雾干燥参数进行优化,得到最佳喷雾干燥条件为:进风温度111.3℃,进料速度161.5 mL/h,热风流量5.1 m3/min,出风温度60℃,雾化器压力0.4 MPa,在此条件下,α-L-鼠李糖苷酶回收率为79.7%。采用确定的工艺和参数条件进行柚苷酶酶制剂制备,得到的酶制剂中α-L-鼠李糖苷酶活力可达19000 U/g,总回收率为78.1%;β-D-葡萄糖苷酶的活力达到4700 U/g,总回收率为28.3%;酶制剂含水量7.5%。通过检测,本研究中制备得到的柚苷酶固体酶制剂的菌落总数、大肠菌群、沙门氏菌以及重金属含量的检测结果完全符合食品工业用酶制剂的安全标准。温度、空气和湿度对柚苷酶酶制剂的储藏稳定性影响较大,光照对其影响不明显。柚苷酶固体酶制剂在-20℃、真空、避光条件下保存70 d,α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶活力的保留率分别为97.6%和86.0%。本研究实现了柚苷酶200 L规模的发酵放大,建立了柚苷酶制剂化工艺流程并优化了过程参数条件,检测了柚苷酶固体酶制剂的食品安全性,探讨了柚苷酶酶制剂储藏稳定性的影响因素,为规模化工业生产柚苷酶酶制剂及柚苷酶应用技术的开发奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 引言
• 1.1 柚苷酶简介
• 1.2 柚苷酶的应用
• 1.2.1 柑橘类果汁脱苦
• 1.2.2 普鲁宁与鼠李糖的工业制备
• 1.2.3 类固醇转化
• 1.2.4 饮料增香
• 1.3 柚苷酶国内外研究现状
• 1.3.1 柚苷酶产生菌的选育
• 1.3.2 柚苷酶的发酵研究
• 1.3.3 柚苷酶分离纯化及酶学性质的研究
• 1.3.4 柚苷酶酶制剂研究
• 1.4 前期研究基础
• 1.5 研究目的与意义
• 1.6 主要研究内容
• 1.6.1 黑曲霉D8056 产柚苷酶发酵放大研究
• 1.6.2 柚苷酶固体酶制剂制备工艺研究
• 1.6.3 柚苷酶固体酶制剂安全性检测与储藏研究
• 第2章 黑曲霉D8056 产柚苷酶发酵放大研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 药品与试剂
• 2.1.4 主要溶液及其配制
• 2.1.5 实验仪器
• 2.1.6 实验方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 7 L 发酵罐产酶实验
• 2.2.2 20 L 发酵罐产酶实验
• 2.2.3 200 L 发酵罐产酶实验
• 2.2.4 不同规模（批次）发酵罐中生物量变化的比较
• 2.2.5 不同规模（批次）发酵罐中α-L-鼠李糖苷酶活力比较
• 2.2.6 不同规模（批次）发酵罐中β-D-葡萄糖苷酶活力比较
• 2.2.7 不同规模发酵罐中发酵结果比较
• 2.3 小结
• 2.3.1 发酵放大过程中的参数条件
• 2.3.2 不同规模发酵过程中柚苷酶活力变化规律
• 第3章 柚苷酶固体酶制剂制备工艺研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验原料
• 3.1.2 药品与试剂
• 3.1.3 实验仪器
• 3.1.4 实验方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 柚苷酶粗酶液浓缩方法的选择
• 3.2.2 柚苷酶固体酶制剂干燥方法的选择
• 3.2.3 喷雾干燥中粗酶液助干剂的选择
• 3.2.4 助干剂添加量的优化
• 3.2.5 喷雾干燥中粗酶液保护剂的选择
• 3.2.6 进风温度对柚苷酶回收率的影响
• 3.2.7 进料速度对柚苷酶回收率的影响
• 3.2.8 热风流量对柚苷酶回收率的影响
• 3.2.9 柚苷酶固体酶制剂喷雾干燥工艺响应面法优化实验
• 3.2.10 柚苷酶固体酶制剂酶活总回收率
• 3.2.11 柚苷酶固体酶制剂制备成本计算
• 3.3 小结
• 3.3.1 柚苷酶固体酶制剂制备工艺流程
• 3.3.2 喷雾干燥中料液配方的优化
• 3.3.3 喷雾干燥条件的优化
• 3.3.4 柚苷酶固体酶制剂的酶活回收率
• 3.3.5 柚苷酶固体酶制剂的制备成本
• 第4章 柚苷酶固体酶制剂安全性检测与储藏研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 药品与试剂
• 4.1.3 实验仪器
• 4.1.4 实验方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 柚苷酶固体酶制剂的食品安全性检测
• 4.2.2 温度对柚苷酶固体酶制剂储藏稳定性的影响
• 4.2.3 温度与空气的复合作用对柚苷酶固体酶制剂储藏稳定性的影响
• 4.2.4 温度、空气和光照的复合作用对柚苷酶固体酶制剂储藏稳定性的影响
• 4.2.5 室内条件下湿度对柚苷酶固体酶制剂储藏稳定性的影响
• 4.2.6 紫外线照射对柚苷酶固体酶制剂稳定性的影响
• 4.3 小结
• 4.3.1 柚苷酶固体酶制剂的安全性检测
• 4.3.2 柚苷酶固体酶制剂的储藏稳定性
• 第5章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.1.1 黑曲霉DB056 产柚苷酶发酵放大研究
• 5.1.2 柚苷酶固体酶制剂制备工艺研究
• 5.1.3 柚苷酶固体酶制剂安全性检测与储藏研究
• 5.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 在学期间发表的学术论文