益母草脂质转运蛋白基因LTP转化普通小麦

论文摘要

小麦是重要的粮食作物之一,小麦的需求量随着经济社会的发展以及世界人口的不断增长而不断提高。小麦病害一直是影响小麦品质与产量的重要因素之一,每年因病害造成的减产高达10%～50%,因此培育高抗病性小麦品种具有重要意义。转基因育种因不受亲缘关系远近的限制,扩大了外源可用抗病基因的范围,同时能有效地缩短育种周期,已成为小麦抗病育种的重要方法。LTP基因由西南大学裴勇炎教授提供,其来源于中药益母草（Leonurus japonicus Houtt）种子,为脂质转运蛋白基因,其编码蛋白在体外具有广谱抑菌作用,在植物中超量表达LTP基因可以提高植物的抗病性。将LTP基因导入烟草和番茄后,获得的转基因烟草对赤星病和青枯病的抗性显著提高,转基因番茄对黄萎病和早疫病的抗性也明显提高。本研究主要是对小麦的遗传转化体系进行进一步的优化从而将LTP基因导入小麦中,以期望获得抗病性稳定提高的小麦品系。1转化条件的筛选通过分析农杆菌抑制剂（头孢霉素和Timentin）对小麦愈伤组织分化的影响,发现在农杆菌介导的遗传转化中,100 mg/L的Timentin为最适的农杆菌抑制浓度,此时分化率达57%。通过筛选继代、分化、生根、叶片涂抹过程中最适PPT筛选浓度,发现在继代过程中为3 mg/L;在分化过程中为2 mg/L;在生根过程中为5 mg/L;在叶片涂抹过程中为10 mg/L。建立了针对Bar基因的筛选体系。2 LTP基因转化小麦为了将LTP基因导入普通小麦中,成功构建了pAHC25-LTP、pBI121-LTP以及pCAMBIA1302 -LTP表达载体。以西农1376、小偃22以及科龙199为受体材料,利用基因枪法、花粉管通道法、农杆菌介导法进行遗传转化。在花粉管通道法中用pAHC25-LTP质粒转化了3000朵小花,获得1670粒种子和31株抗性植株,结实率为55.67%,抗性植株率为1.856%;用pCAMBIA1302-LTP质粒转化了3000朵小花,获得1731粒种子和43株抗性植株,结实率为57.7%,抗性植株率为1.484%。在基因枪法中,用pAHC25-LTP质粒转化了12869块愈伤组织,获得了203株PCR阳性植株,转化率为1.87%,初步证明LTP基因已经导入小麦中。通过对T1代接种小麦条锈菌,结果表明转基因植株对小麦条锈病的抗性有一定的提高,进一步的实验仍在进行中。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 引言
• 1.2 小麦转基因的方法
• 1.2.1 基因枪法
• 1.2.2 农杆菌介导法
• 1.2.3 花粉管通道法
• 1.3 小麦抗病基因转化研究进展
• 1.3.1 小麦抗病毒基因遗传转化
• 1.3.2 小麦抗真菌基因遗传转化
• 1.4 植物脂质转运蛋白基因LTP 研究进展
• 1.4.1 植物脂质转运蛋白基本性质与存在状态
• 1.4.2 脂质转运蛋白的功能
• 1.4.3 LTP 基因转化的意义
• 1.5 小麦转基因面临的问题
• 1.5.1 转化体系不完善
• 1.5.2 外源基因在后代表达中的不确定性和沉默现象
• 1.5.3 转基因安全性
• 1.5.4 我国转基因研究缺少专利
• 1.6 前期遗传转化体系的建立
• 1.6.1 本研究的目的意义
• 1.6.2 研究内容与技术路线
• 1.6.3 主要技术路线如下所示
• 第二章 小麦转化体系的建立与优化
• 2.1 实验材料和方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 实验结果与分析
• 2.2.1 头孢霉素浓度对愈伤组织分化的影响
• 2.2.2 Timentin 对愈伤组织分化的影响
• 2.2.3 Timentin 对农杆菌侵染后愈伤组织分化的影响
• 2.2.4 筛选过程中最适PPT 浓度
• 2.3 讨论
• 第三章 表达载体构建
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 载体pAHC25-LTP 的构建
• 3.2.2 载体pBI121-LTP 和pCAMBIA1302-LTP 的构建
• 3.3 讨论
• 第四章 基因枪法转化小麦
• 4.1 实验材料和方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 实验结果与分析
• 4.2.1 转化植株的获得
• 4.2.2 PPT 涂抹结果
• 4.2.3 转基因植物的分子检测
• 4.2.4 转基因植物的抗病性检测
• 4.3 讨论
• 第五章 农杆菌介导法转化小麦
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 方法
• 5.2 实验结果与分析
• 5.2.1 pBI121-LTP 转化C58C1 菌株的PCR 检测
• 5.2.2 pBI121 转化C58C1 菌株的PCR 检测
• 5.2.3 GUS 染色
• 5.2.4 转化植株的获得
• 5.3 讨论
• 第六章 花粉管通道法转化小麦
• 6.1 实验材料和方法
• 6.1.1 材料
• 6.1.2 方法
• 6.2 实验结果与分析
• 6.3 讨论
• 第七章 总结与后续研究
• 7.1 总结
• 7.1.1 转化条件筛选
• 7.1.2 载体构建
• 7.1.3 LTP 基因转化
• 7.2 后续研究
• 7.2.1 转基因植株抗病性鉴定
• 7.2.2 转基因植株分子生物学鉴定
• 7.3 存在的问题
• 参考文献
• 附录1 实验所需主要试剂的配制
• 附录2 主要试验仪器
• 致谢
• 作者简介