论文摘要
肝X受体（liver X-activated receptor,LXR）是细胞核受体超家族的成员之一。有两种亚型:LXRα和LXRβ。LXRα的表达具有组织特异性,它主要表达在肝脏、肠、肾和巨噬细胞,其中在肝脏表达最高,而LXRβ几乎在所有组织中都有表达,其中在脑表达最高。LXRα和LXRβ两个亚型具有相同的激活配体。内源性配体主要为胆固醇在体内代谢的衍生物氧化甾醇,如24（S）-羟胆固醇、22（R）-羟胆固醇、24（S）-25环氧胆固醇等;外源性人工合成配体有T0901317、GW3965等。作为转录因子,LXRα和LXRβ与配体结合激活后,与其下游基因上游特定的顺式作用元件结合,上调相关基因的转录表达,在胆固醇的吸收、排出、转化及脂肪酸的合成等多个方面发挥调节作用,如促进脑神经细胞内胆固醇向胞外转运（ABCA1和ABCG1）,促进外周组织的胆固醇向肝组织逆向转运（ABCA1、ABCG1和apoE）,促进肝胆固醇向胆汁酸的转变（CYP7A1）,增加肝胆固醇向胆汁中的直接排放（ABCG5和ABCG8）,抑制小肠对胆固醇的吸收（ABCG5和ABCG8）,增加组织脂肪酸的合成（SREBP1-c和FAS）等。胆固醇在肝组织中转化为胆汁酸是体内胆固醇排出体外的重要途径。微粒体的胆固醇7α-羟化酶（cholesterol 7α-hydroxylase,CYP7A1）是途径的限速酶,其活性和表达量受该途径的主要调节者LXRα调解,决定了胆固醇向胆汁酸转化的速度;过氧化物酶体的D-3-羟脂酰辅酶A脱水酶/D-3-羟脂酰辅酶A脱氢酶,简称D-双功能蛋白（D-bifunctional protein, DBP）,也是该途径所必需的酶蛋白,它催化胆汁酸合成前体侧链的缩短。然而,肝脏的LXRα上调靶基因CYP7A1的表达、增加胆汁酸合成时,胆汁酸合成所必须的酶蛋白DBP的表达如何改变,是否会随胆汁酸合成增加而增强,未见报道。大脑是一个富含胆固醇的器官。胆固醇在维持神经元细胞膜的流动性、通透性,提高动作电位沿神经元轴突传导的速度,降低动作电位沿轴突传导所需能量,维持髓鞘的绝缘特性,促进神经元突触的形成并维持其结构的稳定性等方面具有重要作用。HMG-CoA还原酶（HMG CoA R）是胆固醇合成的限速酶,催化脑组织的胆固醇原位合成;ATP结合盒转运蛋白A1（ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1）可将神经细胞内的胆固醇转运至细胞外;胆固醇24S-羟化酶（choleterol-24S-hydroxylase,CYP46）催化胆固醇,生成24S-羟基胆固醇（24S-hydroxycholesterol）后,可通过血脑屏障出脑。LXRβ通过调节其下游基因ABCA1等的表达,调节脑胆固醇的含量。最近研究发现,脑胆固醇与阿尔茨海默病（Alzheimer disease,AD）的发生发展关系密切。β-淀粉样蛋白（β-amyloid peptide, Aβ）是AD发生发展的关键因素。增加细胞胆固醇水平,Aβ的生成、沉积增多;而降低细胞胆固醇合成或减少细胞膜胆固醇的含量,可减少神经元Aβ的生成。抑制在神经元中高表达的LXRβ,降低与胆固醇转出相关蛋白的基因表达,改变胆固醇代谢状态后,神经元Aβ生成相关基因的表达及其分泌量如何改变未见报道。二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid,DHA）是哺乳动物中枢神经系统膜磷脂的一种重要成分,在神经发育和功能方面具有重要作用。DHA合成的最后环节是经过过氧化物酶体β-氧化完成的,DBP参与了这一氧化过程。LXRβ除了在维持胆固醇代谢平衡中具有重要作用外,还可通过调控脂肪酸合成相关基因脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase,FAS）、甾醇调节元件结合蛋白（sterol regulatory element binding protein 1c,SREBP1-c）的表达调节脂肪酸合成。抑制在神经元中高表达的LXRβ,降低与脂肪酸合成相关蛋白的基因表达,减少脂肪酸的合成后,参与DHA最后合成环节的酶蛋白的表达、DHA的量是否受到影响?有待研究。本课题分三部分,分别从三个新的角度探讨LXR在脂质代谢中的作用。第一部分用T0901317和高胆固醇分别激活C57BL/6J小鼠和Wistar大鼠肝脏的LXR,上调胆汁酸合成限速酶CYP7A1的表达,增加胆汁酸的合成后,观察DBP的表达和活性改变。探讨LXR上调肝脏胆汁酸的合成是否与DBP的表达增加有关。第二部分以原代培养的大鼠皮质神经元为研究对象,用反义核酸技术抑制LXRβ的表达,下调ABCA1、CYP46表达后,观察胆固醇和Aβ的量,以及胆固醇合成、APP代谢相关的基因的表达变化。探讨皮质神经元LXRβ在Aβ生成过程中的作用。第三部分以原代培养的大鼠皮质神经元为研究对象,采用反义核酸技术抑制LXRβ的表达,降低与脂肪酸合成相关蛋白的基因表达后,观察过氧化物酶体脂肪酸β-氧化途径中催化DHA合成的酶蛋白ACOX、DBP和SCPX的基因表达以及DHA量的变化。探讨皮质神经元LXRβ在DHA生成过程中的作用。第一部分LXR可通过上调DBP的表达增加胆汁酸合成目的:激活C57BL/6J小鼠和Wistar大鼠肝脏的LXR,上调胆汁酸合成限速酶CYP7A1的表达,增加胆汁酸的合成后,观察DBP的表达和活性改变。探讨LXR上调肝脏胆汁酸的合成是否与DBP的表达增加有关。方法: 20只8～10周龄成年雄性C57BL/6J小鼠随机分为对照组（Con组）和激动剂组（T0组）。两组均给予普通小鼠饲料。激动剂组用LXR激动剂T0901317灌胃（20 mg/kg/d）,对照组只给予T0901317的溶解剂,连续灌胃7 d。灌胃第7天时,将小鼠单笼饲养,收集24 h粪便,用于粪便胆汁酸测定。灌胃第8天,小鼠麻醉后,迅速取出肝脏,置液氮中,用于总RNA提取、DBP蛋白量及活性测定。20只10周龄成年雄性Wistar大鼠随机分为两组。高胆固醇组（CH组）给以高胆固醇饲料（2%胆固醇,10%玉米油,88%标准饲料）喂养;对照组（Con组）给以标准饲料喂养。饲养至第2周。尾静脉取血,确认CH组血胆固醇（2.729±0.757 mmol/L）显著高于Con组（1.426±0.257 mmol/L）后,麻醉大鼠,迅速取下肝脏,置液氮中,用于总RNA提取及DBP活性测定。处死大鼠前1 d单笼饲养收集24 h粪便,用于胆汁酸测定。结果:1胆汁酸水平（用全自动生化分析仪测定）C57BL/6J小鼠激动剂组和对照组的粪便胆汁酸量分别为1.323±0.277μmol/g、1.008±0.205μmol/g;Wistar大鼠高胆固醇组和对照组粪便胆汁酸量分别为5.539±1.710μmol/g、0.575±0.125μmol/g。激动剂组C57BL/6J小鼠和高胆固醇组大鼠的粪便胆汁酸量均高于各自的对照组(P小鼠<0.05,P大鼠<0.01),表明激活LXR后,胆汁酸生成增加。2肝脏CYP7A1、DBP mRNA水平（用RT-PCR法测定） C57BL/6J小鼠激动剂组CYP7A1（0.764±0.067）和DBP（0.806±0.060）的mRNA水平均高于对照组CYP7A1（0.635±0.107）和DBP（0.671±0.049）的mRNA水平(PCYP7A1<0.05,PDBP<0.01); Wistar大鼠高胆固醇组CYP7A1（0.877±0.0664）和DBP（0.881±0.0482）的mRNA水平均高于对照组CYP7A1（0.473±0.0646）和DBP（0.721±0.0635）的mRNA水平（P<0.01）。表明激活的LXR通过上调CYP7A1的表达,增加胆汁酸的合成时,DBP的mRNA表达上调。3肝脏DBP活性的改变（用分光光度法测定）C57BL/6J小鼠激动剂组和对照组肝脏DBP活性分别为15±2.7 U/g pro、11.1±2.4 U/g pro,Wistar大鼠高胆固醇组和对照组肝脏DBP活性分别为11.563±1.911 U/g pro、8.811±2.52 U/g pro。激动剂组C57BL/6J小鼠和高胆固醇组大鼠肝脏的DBP活性均高于各自的对照组(P小鼠<0.01,P大鼠<0.05),表明激活的LXR通过上调CYP7A1的表达,增加胆汁酸的合成时,DBP的活性也增强。4 C57BL/6J小鼠肝脏DBP蛋白量的改变（用Western Blotting法测定）激动剂组C57BL/6J小鼠的DBP蛋白量（12±1.0）高于对照组（10.75±0.866, P <0.05）,表明激活的LXR通过上调CYP7A1的表达,增加胆汁酸的合成时,DBP的酶蛋白水平增多。5肝脏DBP与CYP7A1 mRNA水平的相关性（用SAS软件进行统计学分析）经直线相关分析,C57BL/6J小鼠肝脏DBP mRNA与CYP7A1 mRNA的表达量呈正相关（r=0.6555,P<0.05）;大鼠DBP mRNA与CYP7A1 mRNA的表达量也呈正相关（r=0.74, P<0.05）。表明DBP随CYP7A1表达的增加而增加。小结:LXR增加胆汁酸的合成与DBP表达增强、活性升高有关。第二部分LXRβ在皮质神经元Aβ生成过程中的作用目的:用反义核酸抑制皮质神经元LXRβ的表达,改变胆固醇的代谢,观察Aβ生成相关蛋白基因的表达以及Aβ生成量的变化。探讨皮质神经元LXRβ在Aβ生成过程中的作用。方法:将原代培养的大鼠皮质神经元随机分为反义组（Anti组）、错义组（Mis组）、对照组（Con组）。向每孔Anti组和Mis组神经元加入600μl含500pmol核酸、5μl脂质体的培养液,Con组加入只含有脂质体的培养液。继续培养24h后,收集培养液及神经元。RT-PCR测定胆固醇代谢相关基因ABCA1、HMG CoA R、CYP46以及Aβ生成相关基因APP、BACE1、ADAM10的mRNA水平;Western blotting检测ABCA1、HMG CoA R的蛋白水平;ELISA法测定细胞培养液的Aβ含量;试剂盒酶法测定细胞内外胆固醇含量。结果:1胆固醇代谢相关结果1.1皮质神经元ABCA1mRNA相对表达量（RT-PCR法）和蛋白水平（Western Blotting法）的改变Anti组、Con组和Mis组的ABCA1mRNA相对表达量分别为1.311±0.205、2.395±0.317、2.196±0.397。Anti组的ABCA1 mRNA相对表达量明显低于Con组和Mis组（P<0.01）,Con组和Mis组之间的ABCA1 mRNA相对表达量差异无统计学意义（P>0.05）。Anti组ABCA1的蛋白水平（9.55±2.5）明显低于Con组（79.5±15）和Mis组（78.3±15,P<0.05）,但Con组和Mis组之间的ABCA1蛋白水平差异无统计学意义（P>0.05）。表明抑制LXRβ表达后,参与细胞胆固醇外流的靶基因ABCA1表达下调。1.2皮质神经元培养液胆固醇含量的改变（试剂盒酶法测定）Anti组、Con组和Mis组的培养液胆固醇含量分别为299.487±47.034 mmol/L、356.102±20.430 mmol/L、374.700±44.479 mmol/L。与Con组和Mis组相比,Anti组神经元培养液胆固醇含量降低有统计学意义（P<0.05）,Mis组和Con组相比,培养液胆固醇含量差异无统计学意义（P>0.05）。表明抑制LXRβ表达后,ABCA1表达下调,神经元胆固醇向外排出减少,导致培养液胆固醇含量降低。1.3皮质神经元内胆固醇含量的改变（试剂盒酶法测定）Anti组、Con组和Mis组的神经元内胆固醇含量分别为0.622±0.052 mmol/μg、0.875±0.082 mmol/μg、0.879±0.209 mmol/μg。与Con组和Mis组相比,Anti组神经元内胆固醇含量降低有统计学意义（P<0.01）。Mis组和Con组相比,神经元内胆固醇含量差异无统计学意义（P>0.05）。表明抑制LXRβ表达后,神经元内胆固醇含量降低。1.4皮质神经元HMG CoA R mRNA相对表达量（RT-PCR法）和蛋白水平（Western Blotting法）的改变Anti组HMG CoA R mRNA相对表达量（0.603±0.108）明显低于Con组（0.849±0.201）和Mis组（0.888±0.153,P<0.05）,Con组和Mis组之间的HMG CoA R mRNA相对表达量差异无统计学意义（P>0.05）;Anti组HMG CoA R的蛋白水平（0.840±0.162）明显低于Con组（1.371±0.096）和Mis组（1.513±0.164,P<0.01）,但Con组和Mis组之间的HMG CoA R蛋白水平差异无统计学意义（P>0.05）。表明抑制神经元LXRβ表达后,胆固醇合成的限速酶HMG CoA R的转录和翻译水平均降低,胆固醇合成降低,导致胆固醇含量降低。1.5皮质神经元CYP46 mRNA相对表达量的改变（用RT-PCR法测定）Anti组、Con组和Mis组的CYP46 mRNA相对表达量分别为0.637±0.063、1.025±0.175、1.050±0.182。Anti组的CYP46 mRNA相对表达量明显低于Con组和Mis组（P<0.01）,Con组和Mis组之间的CYP46 mRNA相对表达量无差别（P>0.05）。表明抑制LXRβ表达后,介导CNS胆固醇向外周转运的CYP46表达下调。2 Aβ生成相关结果2.1皮质神经元APP mRNA相对表达量的改变（用RT-PCR法测定）Anti组的APP695和APP751+770mRNA相对表达量分别为0.642±0.114、0.392±0.072,Con组的APP695和APP751+770mRNA相对表达量分别为0.663±0.072、0.727±0.164,Mis组的APP695和APP751+770mRNA相对表达量分别为0.575±0.088、0.841±0.161。Anti组、Con组和Mis组三组之间的APP695mRNA相对表达量差异无统计学意义（P>0.05）;Anti组的APP751+770mRNA相对表达量明显低于Con组和Mis组（P<0.01）,但Con组和Mis组之间的APP751+770 mRNA相对表达量差异无统计学意义（P>0.05）。表明抑制LXRβ表达后,Aβ前体APP的表达下调。2.2 APP代谢关键酶蛋白BACE1、ADAM10 mRNA相对表达量的改变（用RT-PCR法测定）Anti组的BACE1和ADAM10 mRNA相对表达量分别为0.534±0.098、0.471±0.051,Con组的BACE1和ADAM10 mRNA相对表达量分别为0.876±0.095、0.870±0.124,Mis组的BACE1和ADAM10 mRNA相对表达量分别为0.819±0.105、0.862±0.119。Anti组的BACE1和ADAM10 mRNA相对表达量明显低于Con组和Mis组（P<0.01）,Con组和Mis组之间的BACE1和ADAM10 mRNA相对表达量差异无统计学意义（P>0.05）。表明抑制神经元LXRβ表达后,APP的α-分泌酶裂解途径和β-分泌酶裂解途径表达均下调。2.3皮质神经元培养液Aβ含量的改变（用ELISA法测定）Anti组、Con组和Mis组培养液Aβ含量分别为101.140±16.057 pg/ml、157.189±32.603 pg/ml、145.724±37.743 pg/ml。Anti组的培养液Aβ含量明显低于Con组和Mis组（P<0.01）,Con组和Mis组相比差异无统计学意义（P>0.05）。表明抑制LXRβ表达后,不仅Aβ前体APP和β-分泌酶的转录水平降低,神经元Aβ生成量也减少。小结:1皮质神经元LXRβ可影响APP代谢途径相关基因的表达,进而影响Aβ的生成。2皮质神经元LXRβ可影响其非下游基因的表达,影响胆固醇的生成量。第三部分LXRβ在皮质神经元DHA生成过程中的作用目的:采用反义核酸技术抑制大鼠皮质神经元LXRβ的表达,下调脂肪酸合成相关基因的表达。观察DHA的最后合成环节中相关酶蛋白基因的表达以及DHA量的变化。探讨皮质神经元LXRβ在DHA生成过程中的作用方法:将原代培养的大鼠皮质神经元随机分为反义组（Anti组）、错义组（Mis组）、对照组（Con组）。向每孔Anti组和Mis组神经元加入600μl含500pmol核酸、5μl脂质体的培养液,Con组加入只含有脂质体的培养液。继续培养24 h后,收集神经元。RT-PCR测定FAS、SREBP1-c、PPARα、ACOX1、ACOX3、DBP、SCPx、LBP mRNA水平,气相色谱法检测神经元内DHA含量。结果:1皮质神经元FAS和SREBP1-c mRNA相对表达量的改变（用RT-PCR法测定）Anti组的FAS和SREBP1-cmRNA相对表达量分别为0.531±0.034和0.547±0.130,Con组的FAS和SREBP1-c mRNA相对表达量分别为0.701±0.105和1.031±0.163,Mis组的FAS和SREBP1-c mRNA相对表达量分别为0.681±0.126和1.118±0.204。Anti组的FAS和SREBP1-c mRNA相对表达量明显低于Con组和Mis组（P<0.01）,Con组和Mis组之间的FAS和SREBP1-c mRNA相对表达量差异无统计学意义（P>0.05）。表明抑制LXRβ表达后,参与脂肪酸合成的FAS和SREBP1-c表达下调。2皮质神经元ACOX1、DBP和SCPx mRNA相对表达量的改变（用RT-PCR法测定）Anti组的ACOX1 mRNA相对表达量为0.798±0.145,但在相同实验条件下未能检测到Anti组的DBP和SCPx mRNA相对表达量;Con组的ACOX1、DBP和SCPx mRNA相对表达量分别为1.332±0.217、0.560±0.114、0.599±0.077;Mis组的ACOX1、DBP和SCPx mRNA相对表达量分别为1.447±0.130、0.477±0.094、0.615±0.183;Anti组的ACOX1、DBP和SCPx mRNA相对表达量低于Con组和Mis组（P<0.05）,Con组和Mis组之间的ACOX1、DBP和SCPx mRNA相对表达量差异无统计学意义（P>0.05）。表明抑制LXRβ表达后,参与DHA合成的过氧化物酶体直链极长链脂肪酸β-氧化相关酶蛋白ACOX1、DBP和SCPx表达下调。3皮质神经元DHA含量（%）的改变（用气相色谱测定）以DHA占总脂肪酸量的百分比（%）表示神经元内DHA的含量。Anti组的DHA量为3.989±1.193;Con组的DHA量为6.195±1.273;Mis组的DHA量为6.55±0.644。Anti组的DHA量明显低于Con组和Mis组（P<0.05）。Con组和Mis组之间的DHA量差异无统计学意义（P>0.05）。表明抑制皮质神经元LXRβ表达后,催化DHA合成的ACOX1、DBP和SCPx转录减少,进而DHA的生成量减少。4皮质神经元PPARα、ACOX3和LBPmRNA相对表达量的改变（用RT-PCR法测定）在相同实验条件下未能检测到Anti组PPARαmRNA的相对表达量, ACOX3和LBP mRNA的相对表达量分别为0.341±0.069、0.235±0.025;Con组的PPARα、ACOX3、LBP mRNA相对表达量分别为0.806±0.157、0.563±0.142、0.210±0.038;Mis组的PPARα、ACOX3、LBP mRNA相对表达量分别为0.692±0.117、0.623±0.094、0.207±0.043;Anti组的PPARα和ACOX3 mRNA相对表达量明显低于Con组和Mis组（P<0.05）,Con组和Mis组之间的PPARα和ACOX3mRNA相对表达量差异无统计学意义（P>0.05）。Anti组、Con组和Mis组三组之间的LBP mRNA相对表达量差异无统计学意义（P>0.05）。表明抑制LXRβ表达后,参与过氧化物酶体脂肪酸β-氧化的PPARα和ACOX3的mRNA表达明显下调,但LBP的表达却未受影响。小结:1神经元LXRβ可影响DHA最后合成环节中DBP等蛋白的基因转录,进而影响DHA的生成。2神经元LXRβ可影响过氧化物酶体脂肪酸氧化相关酶蛋白基因的转录。结论1 LXR增加胆汁酸的合成与DBP表达增强、活性升高有关。2神经元LXRβ对维持神经元胆固醇代谢平衡有重要意义;抑制神经元LXRβ的表达,可降低Aβ和DHA生成过程中涉及APP代谢以及过氧化物酶体脂肪酸氧化相关基因的表达。