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H5N1流感DNA疫苗和腺病毒载体疫苗的免疫原性研究

2020-12-03阅读(180)

H5N1流感DNA疫苗和腺病毒载体疫苗的免疫原性研究

论文摘要

自1997年H5N1禽流感病毒开始感染人以后,人间病例不断发生,在泰国、印度尼西亚、中国和巴基斯坦还出现过有限的人传人的病例,这表明H5N1流感病毒正在不断进化,一旦H5N1流感病毒获得人传人的能力,引起的世界大流行将给人类带来巨大的灾难。目前防控流感/禽流感最有效的措施仍为接种疫苗。而基于鸡胚生产的季节性流感疫苗的生产能力是有限的,因此,如何缩小当前疫苗生产能力与大流行期间疫苗巨大需求量的差距,提高疫苗产量是全球流感大流行疫苗研究的一个热点问题。提高疫苗产量除了加强、扩大灭活疫苗的生产能力外,提高疫苗主要成分血凝素（HA）蛋白的表达量从而减少疫苗的使用量也是一种有效的方法。本研究拟构建针对H5N1流感病毒的DNA疫苗和腺病毒载体疫苗,通过优化HA基因的密码子,大大提高血凝素的表达水平,从而提高疫苗的免疫效果。另外,目前针对流感大流行疫苗的研究多采用Clade1的H5N1香港株或越南株,然而我国流行的H5N1流感病毒株基本上都是Clade2.3.4的毒株,与Clade1的毒株在抗原性上有很大不同,因此本研究选用中国的分离株具有重要意义。本研究以我国人感染病例中分离到的、WHO推荐的Clade2.3.4疫苗候选株A/Anhui/1/2005（H5N1）为研究对象,首先按照人的偏爱密码子将H5N1（A/Anhui/1/2005）流感病毒的HA基因进行优化改造,以提高其表达量,经全基因合成后,插入到真核表达载体pDC315中,构建了真核表达质粒pDC315-Mod.HA;将此质粒和含野生HA基因的真核表达质粒pDC315-Wt.HA分别转染293T细胞,比较HA蛋白的表达量。在比较密码子优化效果之后,将优化的HA基因Mod.HA插入DNA疫苗载体——pVR-1012,构建了一种H5N1流感病毒的DNA疫苗pVR-Mod.HA;又利用AdMaxTM腺病毒包装系统,分别构建了Ad-Wt.HA和Ad-Mod.HA两个腺病毒载体疫苗;最后采用BALB/c小鼠单独或者联合免疫方法,评价不同疫苗和不同免疫策略所诱导的体液免疫及细胞免疫效果,并就疫苗诱导的中和抗体研究了其对8株不同H5N1流感病毒的交叉反应性。结果表明:1)密码子优化后HA蛋白在293T细胞中的表达水平显著提高,而且疫苗诱导小鼠产生的体液免疫和细胞免疫效果也有明显提高;2)本研究构建的优化的腺病毒载体疫苗不仅能够有效诱导出中和抗体,而且对中国分离的不同年代不同地域的H5N1流感病毒普遍具有较强的中和作用;3)单独免疫两次优化的腺病毒载体疫苗能够诱导较强的体液免疫和细胞免疫,而且都显著优于单独免疫两次DNA疫苗;4) DNA疫苗初免-腺病毒载体疫苗加强的免疫策略是一种相对较好的联合免疫策略,值得进一步研究;5)从A/Anhui/1/2005（H5N1）HA全序列中筛选到了两个能够刺激BALB/c小鼠CD8+T淋巴细胞分泌IFN-γ的表位,即HA212-229:TYISVGTSTLNQRLVPKI和HA534-543:IYSTVASSLA,后者比前者强。

论文目录

  • 主要英文缩写词
  • 摘要
  • Abstract
  • 前言
  • 第1章 H5N1流感病毒HA基因的密码子优化
  • 第一节 材料与方法
  • 一、 材料
  • 1、毒株、HA基因序列和细胞
  • 2、质粒和菌株
  • 3、工具酶、试剂
  • 二、 方法
  • 1、人、小鼠和流感病毒的密码子使用频率分析
  • 2、HA基因的密码子优化
  • 3、真核表达质粒的构建及制备
  • 4、真核表达质粒体外转染293T细胞
  • 5、间接免疫荧光检测HA基因在细胞中的表达
  • 6、Western Blot比较Wt.HA和Mod.HA在细胞中的表达水平
  • 第二节 结果
  • 一、密码子选用情况
  • 二、真核表达质粒的酶切鉴定结果
  • 三、间接免疫荧光（IFA）和Western Blot实验检测HA表达水平
  • 第三节 小结
  • 第2章 DNA疫苗pVR-Mod.HA的构建及制备
  • 第一节 材料与方法
  • 一、材料
  • 1、质粒和菌株
  • 2、工具酶、试剂
  • 3、引物设计合成
  • 二、方法
  • 1、本研究所用到的质粒操作基本实验方法
  • 2、克隆载体pMD18T-Mod.HA的构建
  • 3、质粒pVR-Mod.HA的构建
  • 4、DNA疫苗pVR-Mod.HA的制备
  • 5、pVR-Mod.HA的真核瞬时表达鉴定
  • 第二节 结果
  • 一、质粒pVR-Mod.HA的构建
  • 二、PCR及酶切鉴定结果
  • 三、间接免疫荧光鉴定结果
  • 第三节 小结
  • 第3章 腺病毒载体疫苗的构建及制备
  • 第一节 材料与方法
  • 一、材料
  • 1、腺病毒包装系统和细胞
  • 2、质粒和菌株
  • 3、试剂和抗体
  • 二、方法
  • 1、高质量质粒的制备
  • 2、重组腺病毒及扩增纯化
  • 3、重组腺病毒的鉴定
  • 4、腺病毒滴度测定
  • 第二节 结果
  • 一、重组腺病毒鉴定结果
  • 二、重组腺病毒滴度测定结果
  • 第三节 小结
  • 第4章 小鼠实验及免疫效果评价
  • 第一节 材料与方法
  • 一、材料
  • 1、实验动物
  • 2、疫苗
  • 3、H5N1流感病毒和细胞
  • 4、培养基、试剂和仪器
  • 二、方法
  • 1、小鼠免疫
  • 2、血清和脾淋巴细胞的采集
  • 3、马红细胞血凝抑制实验（HI）检测H5抗体
  • 4、微量中和实验（MN）检测中和抗体
  • 5、ELISPOT实验
  • 6、流式细胞实验
  • 第二节 结果
  • 一、马红细胞血凝抑制实验（HI）结果
  • 二、微量中和实验（MN）结果
  • 三、HA表位筛选结果
  • 四、ELISPOT实验结果
  • 五、流式细胞实验结果
  • 第三节 小结
  • 讨论
  • 结论
  • 综述
  • 参考文献
  • 已发表论文
  • 致谢

    • 相关论文文献

    • [1].本刊组织构建栏目已出版“腺病毒载体构建”的相关文章[J]. 中国组织工程研究与临床康复 2011(07)
    • [2].腺病毒载体在基因治疗中的应用进展[J]. 科技信息 2011(20)
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