论文摘要
目的：炎性乳腺癌是原发性乳腺癌中恶性度最高的肿瘤,约占全部乳腺癌的1%-6%。IBC亦是一种特殊的局部晚期乳腺癌,肿瘤细胞侵袭性和转移性强,死亡率非常高。IBC组织学无明显特异性,可表现为浸润性导管癌、小叶细胞癌等,常见血管和淋巴管癌栓。IBC肿瘤细胞呈低分化,并多伴局部淋巴结浸润。由于IBC恶性程度极高,病情发展迅速,早期即有全身广泛转移而危及生命,预后非常差。当前临床上主要采取以手术、放疗、化疗等综合治疗措施来处理这类疾病,但是治疗效果极其有限。近年来,有研究发现,癌基因RhoC在绝大多数炎性乳腺癌中广泛表达,并且参与IBC的生长、侵袭和转移等生物学活动。这一发现为IBC的分子靶向治疗提供了方向。本研究旨在探讨利用RNA干扰技术沉默IBCSUM190细胞株RhoC基因,分析其对IBC SUM190细胞增殖、侵袭和转移能力的影响。方法：收集66例乳腺良性疾病组织和94例乳腺癌组织,采用免疫组化方法,应用彩色图像灰度扫描分析系统检测RhoC蛋白的表达,并分析其临床意义。在体外实验中,人IBC SUM190细胞随机分成对照组与实验组,对照组不加转染试剂仅加细胞培养液,实验组加入转染试剂脂质体2000和相关试剂正常转染。以脂质体介导的RhoC-siRNA转染人IBC SUM190细胞株。转染后48小时,以半定量RT-PCR检测人IBC SUM190细胞中RhoC mRNA的表达水平,以Western blot法测定人IBC SUM190细胞中RhoC蛋白的表达水平。在转染后0、24、48、72小时时间点,以MTT法检测人IBC SUM190细胞生长情况。细胞生长速度以吸光度A值表示。在转染后48小时,应用流式细胞仪检测人IBC SUM190细胞的凋亡情况。应用transwell小孔法检测人IBC SUM190细胞的侵袭和转移能力的变化。在细胞侵袭实验中,穿膜细胞数代表肿瘤细胞侵袭能力；在细胞转移试验中,穿膜细胞数代表肿瘤转移运动能力。采用RT-PCR法检测RhoC-siRNA转染人IBC SUM190细胞后KAI1、MMP9、CXCR4 mRNA的表达。另外,采用免疫细胞化学法分析RhoC-siRNA转染后人IBC SUM190细胞中KA1、MMP9、CXCR4蛋白的表达情况。结果：RhoC蛋白在乳腺良性疾病组织和乳腺癌组织中表达的平均灰度值分别为（0.051±0.014）、（0.328±0.122）,二者之间差异有统计学意义（P<0.01）。RhoC蛋白在年龄<45岁和≥45岁乳腺癌中表达的平均灰度值分别为（0.307±0.111）、（0.358±0.172）,二者之间差异无统计学意义（P>0.05）。无腋淋巴结转移乳腺癌中RhoC蛋白表达的平均灰度值（0.266±0.107）,有腋淋巴结转移乳腺癌中RhoC蛋白表达的平均灰度值（0.409±0.187）,二者之间差异有统计学意义（P<0.05）。Ⅰ+Ⅱ期乳腺癌中RhoC表达的平均灰度值（0.237±0.088）,Ⅲ期乳腺癌中RhoC表达的平均灰度值（0.435±0.211）,二者之间差异有统计学意义（P<0.05）。在体外实验中,以RhoC-siRNA转染人IBC SUM190细胞,发现转染效率可以达到70%。转染后48小时,对照组中人IBC SUM190细胞RhoC mRNA表达水平（0.907±0.387）,实验组中人IBC SUM190细胞RhoC mRNA表达水平（0.367±0.152）,二者之间差异有统计学意义（P<0.01）。对照组中人IBC SUM190细胞RhoC蛋白表达水平（0.914±0.389）,实验组中人IBC SUM190细胞RhoC蛋白表达水平（0.375±0.164）,二者之间差异有统计学意义（P<0.01）。在转染后0、24、48、72小时各时间点,对照组人IBC SUM190细胞生长速度（吸光度A值）分别为（0.43±0.09）、（0.57±0.20）、（1.32±0.48）、（1.88±0.68）,实验组人IBC SUM190细胞生长速度（吸光度A值）分别为（0.45±0.12）、（0.50±0.17）、（1.28±0.40）、（1.75±0.57）,四个时相点二者之间的差异均无统计学意义（P>0.05）。对照组IBC SUM190细胞G0/G,期细胞比例（52.26±3.68）%,实验组IBC SUM190细胞G0/G1期细胞比例（55.38±3.85）%,二者之间差异无统计学意义（P>0.05）。对照组IBC SUM190细胞S期细胞比例（23.78±1.42）%,实验组IBC SUM190细胞S期细胞比例（21.15±1.26）%,二者之间差异无统计学意义（P>0.05）。对照组人IBC SUM190细胞凋亡率（4.77±0.34）%,实验组人IBC SUM190细胞凋亡率（5.25±0.45）%,二者之间差异无统计学意义（P>0.05）。在细胞侵袭实验中,对照组人IBC SUM190细胞穿膜细胞数（352.2±50.6）,实验组人IBC SUM190细胞穿膜细胞数（85.6±12.7）,二者之间差异有统计学意义（P<0.05）。在细胞转移实验中,对照组人IBC SUM190细胞穿膜细胞数（189.6±23.3）,实验组人IBC SUM190细胞穿膜细胞数（46.6±7.7）,二者之间差异有统计学意义（P<0.05）。RhoC-siRNA转染人IBC SUM190细胞48小时后,对照组、实验组KAI1 mRNA表达水平分别为（0.462±0.192）、（0.762±0.281）,二者之间差异有统计学意义（P<0.05）。对照组、实验组MMP9 mRNA表达水平分别为（0.889±0.349）、（0.587±0.212）,二者之间差异有统计学意义（P<0.05）。对照组、实验组CXCR4 mRNA表达水平分别为（0.873±0.331）、（0.620±0.277）,二者之间差异有统计学意义（P<0.05）。KAI1蛋白在对照组和实验组中表达分别为（0.54±0.11）、（1.13±0.39）,二者之间差异有统计学意义（P<0.05）。MMP9蛋白在对照组和实验组中表达分别为（1.28±0.45）、（0.68±0.20）,二者之间差异有统计学意义（P<0.05）。CXCR4蛋白在对照组和实验组中表达分别为（1.35±0.50）、（0.77±0.23）,二者之间差异有统计学意义（P<0.05）。结论：RhoC蛋白在原发性乳腺癌组织中高表达,其表达与肿瘤病理特征密切相关。肿瘤恶性度高,RhoC蛋白相应高表达。RhoC表达与乳腺癌淋巴结转移、TNM分期呈正相关。RhoC在人IBC SUM190细胞中广泛表达,在IBC的发生、发展中发挥重要作用。通过RNA干扰靶向沉默RhoC基因,可以调控RhoC蛋白低表达,从而显著抑制IBC SUM190细胞的侵袭和转移能力,但是并不能限制IBC SUM190细胞的增殖活动。
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