论文摘要
目的自然杀伤T细胞（natural killer T cells,NKT）是免疫细胞中一类具有特定标志的T淋巴细胞亚群,也是机体重要的免疫调节细胞。细胞表面可以共表达NK细胞和T细胞的表面标记分子:α/βTCR与NK1.1、CD16、LY49A、LY49C等。NKT细胞表面半恒定TCR的表达具有高度的限制性。与B细胞和传统T细胞不同,NKT细胞不能识别由主要组织相容性复合物（MHC）递呈的多肽,只能特异性识别由抗原递呈细胞表面CD1d分子所递呈的糖脂类分子,NKT细胞活化后能够迅速分泌大量的Th1（IFN-γ）型和Th2（IL-4）型细胞因子,这些细胞因子是NKT细胞执行免疫调节功能的关键分子,在固有免疫和获得性免疫间发挥着桥梁作用。近年来关于NKT细胞功能和调节的研究引起了人们极大的兴趣,成为免疫学研究的一个新热点。研究发现,一种来源于海洋生物海绵提取物的糖脂类物质——α-半乳糖神经酰胺（α-Galactosylceramide,α-GalCer）具有直接激活NKT细胞的能力,是公认的NKT细胞外源性配体。大量动物实验证实了α-GalCer在抗肿瘤及调节自身免疫性疾病过程中的积极作用。但是,随着研究的深入,人们越来越深刻地意识到α-GalCer这种强大的NKT细胞激活剂所带来的副作用,主要包括:诱导NKT细胞无能、造成急性肝脏损伤、导致动物流产、加重粥样硬化等等。最近,Zhou等报道了一个内源性NKT细胞配体iGb3,也具有活化小鼠和人NKT细胞的作用,但其激活作用远差于外源性配体α-GalCer。因此有目的的对糖脂进行改造或寻找其他NKT细胞激活剂已成为应用糖脂类药物进行临床治疗所亟需。基于此目的,我们将糖脂α-GalCer和iGb3分子进行适当的化学修饰和改造,通过比较α-GalCer与经过化学修饰的糖脂类似物结构上的差异,观察它们激活NKT细胞能力的不同,希望从中筛选出优势诱导Th1或者Th2细胞因子分泌的类似物,深入探讨Th1/Th2反应偏移的结构基础,为今后合理设计糖脂药物并应用于临床抗肿瘤和抗感染治疗打下基础。方法（1） ELISA法筛选具有Th1/Th2型细胞因子分泌优势的α-GalCer和iGb3类似物。将6-8周龄成年C57BL/6雄鼠分组,每组设三只小鼠,通过腹腔给药的方法,分别注射5种α-GalCer类似物和7种iGb3类似物,在给药后不同时间点收集小鼠血清,通过血清的ELISA检测,动态观察药物对小鼠血清中Th1型细胞因子IFN-γ和Th2型细胞因子IL-4分泌的影响,筛选具有优势诱导Th1型或者Th2型细胞因子分泌能力的α-GalCer和iGb3类似物。（2）证实所筛选出的iGb3类似物能够活化小鼠NKT细胞,发挥优势诱导作用。将ELISA法筛选出的两种具有Th1型细胞因子分泌优势的iGb3类似物注射到小鼠体内,在给药后不同时间点处死小鼠,同时分离小鼠肝脏和脾脏淋巴细胞,通过流式细胞仪检测用药后小鼠肝脏和脾脏中NKT细胞的数量变化情况,分析肝脏NKT细胞早期活化标志CD69分子的表达情况。（3）证明所筛选出的两种iGb3类似物能够优势诱导活化肝脏和脾脏NKT细胞分泌IFN-γ。将筛选出的两种具有Th1型细胞因子分泌优势的iGb3类似物注射到小鼠体内,在用药后不同时间点处死小鼠,分离小鼠肝脏和脾脏淋巴细胞,通过流式细胞仪检测小鼠肝脏和脾脏NKT细胞群中产生IFN-γ和IL-4的阳性细胞比例情况。（4）观察所筛选出的具有优势诱导NKT细胞Th1型细胞因子分泌能力的iGb3类似物的抗肿瘤作用。分离培养C57BL/6小鼠骨髓来源的DC细胞,将其负载上糖脂4′′′-dh-iGb3,共孵育后通过尾静脉注射到荷瘤小鼠的体内,分别在荷瘤后第一周和第四周观察肿瘤的生长情况。结果一、4-HO-iGb3和4′′′-dh-iGb3具有优势诱导Th1型细胞因子分泌的能力。收集给药后不同时间点（4h、6h、12h、24h、48h）C57BL/6小鼠尾静脉血,离心吸取血清,双抗体夹心酶联免疫法（ELISA）检测药物作用后小鼠血清中IFN-γ和IL-4的分泌情况。结果发现,经过化学修饰的两种iGb3类似物4-HO-iGb3和4′′′-dh-iGb3具有优势诱导Th1型细胞因子分泌的能力。而经过化学修饰的几种α-GalCer类似物诱导细胞因子分泌的能力较差。二、4-HO-iGb3和4′′′-dh-iGb3这两种iGb3类似物能够活化小鼠NKT细胞,并通过小鼠肝脏和脾脏淋巴细胞分泌IFN-γ。分离小鼠肝脏和脾脏组织,提取肝脏和脾脏淋巴细胞,流式细胞术分析注射PBS、iGb3、4-HO-iGb3、4′′′-dh-iGb3后不同时间点各组别小鼠肝脏和脾脏中NK1.1+CD3+（双阳）的NKT细胞数量变化情况,同时检测肝脏这群双阳性细胞表面活化标记CD69的表达情况。结果表明,给予糖脂4-HO-iGb3和4′′′-dh-iGb3对NKT细胞的数量影响不大,但两用药组NKT细胞表面分子CD69的表达高于溶媒对照组,证实4-HO-iGb3和4′′′-dh-iGb3这两种iGb3类似物确实能够活化NKT细胞。同时通过胞内染色检测NK1.1+CD3（+双阳）的NKT细胞胞内的IFN-γ和IL-4的表达情况,发现4-HO-iGb3和4′′′-dh-iGb3组NKT细胞内IFN-γ阳性的细胞比例要高于未经过修饰的iGb3组,且IFN-γ+/IL-4+的细胞比例大于1,说明4-HO-iGb3和4′′′-dh-iGb3能够活化小鼠NKT细胞分泌IFN-γ,而以4′′′-dh-iGb3的作用更为明显。三、DC负载的糖脂分子4′′′-dh-iGb3能够明显抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长。我们无菌分离C57BL/6小鼠的股骨和胫骨,加入细胞因子GM-CSF和IL-4体外诱导骨髓来源的DC细胞分化成熟,然后将成熟的DC细胞负载上药物,通过小鼠尾静脉注射到荷瘤小鼠体内,观察DC细胞负载的药物对荷瘤小鼠肿瘤的生长情况的影响,发现DC细胞负载的4′′′-dh-iGb3组与DC+ iGb3组、DC+溶媒组相比较能够有效的抑制小鼠黑色素瘤的生长,起到抑瘤作用。结论（1）化学修饰的iGb3类似物4-HO-iGb3和4′′′-dh-iGb3能够激活小鼠NKT细胞,并优势诱导NKT细胞分泌IFN-γ,而以4′′′-dh-iGb3的作用更为明显。（2） DC负载的4′′′-dh-iGb3能够明显抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长。（3） 4′′′-dh-iGb3可以作为一种新型的非特异性免疫佐剂用于抗肿瘤治疗。