论文摘要
大量蛋白尿是慢性肾病（chronic kidney disease,CKD）最常见的临床表现之一,它不仅是反映肾小球损伤程度的重要标志,还可以引起肾小管间质损伤促使肾脏病变持续进展,是CKD病程进展中的一个独立危险因素。白蛋白是肾小球疾病蛋白尿中的主要成分。研究表明,白蛋白超负荷可激活肾小管上皮细胞产生大量炎性介质、细胞因子、生长因子以及细胞外基质蛋白等;还可介导肾小管上皮细胞凋亡和转分化,导致肾间质纤维化发生。研究表明,肾小管上皮细胞过度凋亡是肾小管萎缩的重要病理生理基础之一。目前,较为肯定的蛋白尿诱导肾小管上皮细胞凋亡的机制主要有:死亡受体通路（Fas-FADD-caspase8）途径、过氧化物酶增殖物激活受体（PPAR-γ）途径、NF-κB途径以及线粒体凋亡途径。内质网应激（endoplasmic reticulum stress, ERS）启动的凋亡途径是近年才发现的一条新的凋亡途径,它通过PERK（PKR-like ER kinase）、ATF6（activating transcription factor 6）以及IRE-1（inositol requiring kinase 1）三个信号通路激活下游的凋亡信号分子如CHOP（CCAAT/enhancer-binding protei-homologous protein,也称为GADD153）、c-Jun氨基酸末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）、caspase-12以及Bcl-2家族等靶基因导致细胞凋亡。越来越多的研究证明,ERS诱导的细胞凋亡在肿瘤、糖尿病、神经系统退行性变及心血管疾病等很多疾病的发生发展过程中起十分重要的作用。但是,对于内质网相关的细胞凋亡途径在慢性肾病进程中的作用及机制所知甚少。CHOP是内质网应激特异的转录因子,属C/EBP转录因子家族成员,内质网应激激活CHOP是引起细胞凋亡最重要的信号途径。PERK、ATF6以及IRE-1的活化都诱导CHOP转录,其中,PERK在CHOP蛋白表达中其关键作用。有研究显示,内质网应激诱导剂衣霉素可以显著上调肾组织CHOP基因表达,引起肾小管上皮细胞凋亡和肾组织损伤,CHOP基因缺乏小鼠的肾小管上皮细胞对衣霉素的作用则表现出细胞凋亡反应降低,均提示CHOP在内质网应激引起的肾损伤中具有十分重要的作用。据此,我们推测:蛋白尿可能通过活化CHOP诱导肾小管上皮细胞凋亡;PERK的激活可能是调控这一病理生理过程的主要环节。本课题总体思路如下图所示:一、实验方法（一）慢性肾病患者肾小管上皮细胞内质网应激与细胞凋亡的关系1.研究对象根据1999年美国肾脏病基金会（NKF）公布的新的CKD定义,选取本院住院患者经临床和肾活检确诊为CKD的病例21例,并按照患者24h尿蛋白定量水平将病例分为:轻度蛋白尿组（<1.5g/24h,7例,其中IgA肾病4例,系膜增生性肾小球肾炎3例）、中度蛋白尿组（1.5～3.5g/24h,7例,其中IgA肾病4例,系膜增生性肾小球肾炎3例）、重度蛋白尿组（>3.5g/24h,7例,其中IgA肾病3例,系膜增生性肾小球肾炎4例）。对照组7例,均取自肾肿瘤患者切除肾脏的远离肿瘤部分并经病理检查证实为正常肾组织,尿检蛋白<150mg/24h。2.检测指标及方法常规生化方法检测血浆白蛋白、脂蛋白、肌酐及24小时尿蛋白定量,HE、PAS、PASM以及Masson染色观察肾组织学改变,肾小管上皮细胞ORP150、GRP78及CHOP表达采用免疫组化方法检测,细胞凋亡采用TUNEL法检测。（二）内质网源性转录因子CHOP在白蛋白超负荷诱导肾小管上皮细胞凋亡中的作用及其调控机制1.白蛋白超负荷对肾小管上皮细胞GRP78、CHOP、PERK表达,PERK磷酸化及细胞凋亡的影响（1）分别以0、5、10、20mg/ml的白蛋白刺激HKC细胞24小时,用western blot方法检测GRP78、CHOP、PERK蛋白表达水平以及PERK磷酸化水平,观察它们与白蛋白作用的量效关系;采用膜联蛋白V/碘化丙锭（Annexin V-FITC/PI）双染的流式细胞术检测细胞凋亡变化。（2）以20mg/ml白蛋白刺激HKC细胞12、24、36小时,以0mg/ml白蛋白刺激HKC细胞0、24小时为对照,用western blot方法检测GRP78、CHOP、PERK蛋白表达水平以及PERK磷酸化水平,观察它们与白蛋白作用的时效关系;采用膜联蛋白V/碘化丙锭（Annexin V-FITC/PI）双染的流式细胞术检测细胞凋亡变化。2. CHOP基因沉默对白蛋白超负荷诱导肾小管上皮细胞凋亡的影响（1）采用RT-PCR检测CHOP siRNA对白蛋白诱导HKC细胞CHOP mRNA表达的抑制作用。（2）采用western blot方法,检测CHOP siRNA对白蛋白诱导HKC细胞CHOP、PERK蛋白表达及PERK磷酸化的影响。（3）采用膜联蛋白V/碘化丙锭（Annexin V-FITC/PI）双染的流式细胞术检测CHOP siRNA对白蛋白诱导HKC细胞凋亡的影响。3. PERK基因沉默对白蛋白超负荷诱导肾小管上皮细胞CHOP表达及细胞凋亡的影响（1）采用RT-PCR检测PERK siRNA对白蛋白诱导HKC细胞CHOP mRNA及PERK mRNA表达的抑制作用。（2）采用western blot方法,检测PERK siRNA对白蛋白诱导HKC细胞CHOP、PERK蛋白表达及PERK磷酸化的影响。（3）采用膜联蛋白V/碘化丙锭（Annexin V-FITC/PI）双染的流式细胞术检测PERKsiRNA对白蛋白诱导HKC细胞凋亡的影响。二、实验结果（一）慢性肾病患者肾小管上皮细胞内质网应激与细胞凋亡的关系对照组肾小管上皮细胞胞浆内ORP150、GRP78、CHOP呈极低水平的表达。CKD患者肾小管上皮细胞胞浆内ORP150、GRP78表达显著增加（P<0.01）;胞核内CHOP表达呈强阳性（P<0.01）;细胞凋亡亦明显增多（P<0.01）;相关性分析表明,ORP150、GRP78、CHOP的表达及细胞凋亡均与24小时尿蛋白量呈正相关（r=0.695,r=0.760,r=0.753,r=0.835,P<0.01）。各组间肾小管上皮细胞CHOP表达与细胞凋亡呈正相关（r=0.765,P <0.01）。（二）内质网源性转录因子CHOP在白蛋白超负荷诱导肾小管上皮细胞凋亡中的作用及其调控机制1.白蛋白超负荷与肾小管上皮细胞GRP78、CHOP、PERK表达,PERK磷酸化及细胞凋亡的量效及时效关系（1）肾小管上皮细胞GRP78、CHOP、PERK表达,PERK磷酸化及细胞凋亡随白蛋白浓度增加而进行性上调（P<0.01）。（2）以20mg/ml白蛋白刺激HKC细胞, GRP78、CHOP、PERK,PERK磷酸化及细胞凋亡随培养时间延长而进行性增加（P<0.01）。2. CHOP基因沉默对白蛋白超负荷诱导肾小管上皮细胞凋亡的影响CHOP siRNA显著抑制白蛋白诱导的HKC细胞CHOP mRNA表达及蛋白表达（P<0.01）,对PERK蛋白表达无明显影响,对PERK磷酸化有显著的上调作用（P<0.01）,同时,对白蛋白诱导的HKC细胞凋亡有显著的抑制作用（P<0.01）。3. PERK基因沉默对白蛋白超负荷诱导肾小管上皮细胞CHOP表达及细胞凋亡的影响PERK siRNA显著抑制白蛋白诱导的HKC细胞CHOP mRNA、PERK mRNA表达及它们的蛋白表达（P<0.01）,对白蛋白诱导PERK磷酸化有显著的抑制作用（P<0.01）,同时,对白蛋白诱导的HKC细胞凋亡有显著的抑制作用（P<0.01）。三、结论1.内质网过度应激可能参与了CKD患者肾小管上皮细胞的损伤。CHOP的表达上调及核转位可能与蛋白尿诱导肾小管上皮细胞凋亡有密切关系。2.白蛋白呈时间、剂量依赖性上调HKC细胞GRP78、CHOP、PERK表达及PERK磷酸化,与细胞凋亡增多的变化规律一致,提示PERK-CHOP途径可能与白蛋白超负荷诱导HKC细胞凋亡有关。3.内质网源性转录因子CHOP表达上调可能是白蛋白超负荷诱导的肾小管上皮细胞凋亡的重要环节。4.白蛋白超负荷可通过活化PERK上调CHOP表达引起肾小管上皮细胞内质网相关的细胞凋亡,这可能是蛋白尿相关性肾间质损伤的主要机制。