油菜雌蕊原位转基因方法

论文摘要

油菜在分类上属芸苔属植物,包括重要的油料作物和蔬菜。传统的芸苔属植物转基因方法是基于组织培养的根癌农杆菌介导法。这类方法存在的主要问题是转化效率低,转化和再生受基因型影响,重复性差,严重限制了芸薹属作物的基因研究和分子育种。目前甘蓝、白菜和甘蓝型油菜三物种的全基因组测序即将完成,将产生大量的功能基因。开发一种不依赖于基因型的、高效高通量的油菜转基因方法意义重大,既可以为基因研究创建突变群体,又可以为优良性状的转基因育种研究提供方法和技术平台。本研究借鉴花粉管通道法,通过建立和优化油菜的雌蕊原位转化方法,分析甘蓝型油菜的转化时间、外源DNA溶剂和雌蕊处理方式对转化的影响,研究转基因的遗传规律,建立了一套高效可重复的甘蓝型油菜基因转化体系。继而通过比较不同白菜型油菜、甘蓝和甘蓝型油菜品种的花粉管生长规律和转化率,得到表达报告基因的除草剂抗性植株,实现了不同类型和基因型油菜的高效转化,扩展了方法的应用范围。在此基础上,本文通过分析外源GUS基因在转化种子中的表达形式,探讨了雌蕊原位转化法的生物学机理,从理论上分析了这种转基因方法的基因型非依赖性和核遗传规律。研究的结果将对油菜的转基因研究和应用起到良好的推动作用。本研究取得的主要结果如下:1.花粉管生长观察。通过对花粉管进行组织化学染色和光镜观察,比较研究了甘蓝型油菜、白菜型油菜和甘蓝的花粉管生长规律。发现供试的甘蓝品种及甘蓝型油菜品种的花粉管生长规律基本相同,授粉后12～18h在子房中穿行并开始发生90°左右的转折,然后沿珠柄向珠孔延伸。白菜型油菜花粉粒萌发早, 6～8h后花粉管束密集地穿越花柱进入子房。2.转化方法的初步确定。根据油菜花器官特征、授粉受精过程和预实验结果,初步确定了甘蓝型油菜的雌蕊原位转基因方法的操作程序:选择健壮植株上的主花序和上部第一次分枝,去除已经开放的花和角果,去除长度3mm以下的花蕾;剥开1～3d后即将开放的花蕾,去除花药,露出雌蕊的柱头和花柱。人工授粉后切除雌蕊的一小部分柱头,在新鲜的切面上点滴2～3μl质粒溶液（5μg/μl）;角果成熟后收获种子。用此方法,从收获的种子中筛选到12株PCR阳性的转基因幼苗。3.以中双9号为转化对象,研究优化了影响该转基因方法的主要因素。1)探索了最适合的转化时间。授粉后6h进行转化,从转化处理的种子中筛选得到了5株除草剂抗性苗,转化率约为1.8%。随着从授粉到转化操作的时间延长,转化率逐渐升高,授粉后12～18h转化的转化效率最高,达到4%,之后转化率很快降低,从21h的2.7%降到24h的0.3%,而27h后转化的效率率为0。据此确定授粉后12～18h为甘蓝型油菜最佳的转化时间。这一时间与花粉管发生向胚囊转折的时间相吻合。转化效率的计算方法为:抗除草剂的转基因幼苗÷处理的雌蕊数×100.2)探索了最佳的雌蕊/柱头的切除方式。结果发现,当花柱被切除一半时,结实率居中,但转化率最高（3.8%）;切柱头的一半时结实率最高,转化率仅1.8%;花柱全部切除时结实率最低,转化率也只有0.9%。因此,平衡结实率和转化率,确定花柱切除一半为最佳切除方式。3)探索了最佳的外源DNA溶剂种类。实验以植物表达载体pGreen0229为bar基因供体,分别以0.1×SSC+10mMCaCl2、0.1×SSC、0.5×SSC和1×SSC为溶剂。结果发现,以0.1×SSC+10mMCaCl2为溶剂结实率最高（每角果13.9粒）,但转化率仅0.4%;而以0.1×SSC为溶剂结实率最低（每角果11.2粒）,转化率最高,为5.4%。平衡结实率和转化率,确定以0.1×SSC为载体溶剂最佳。4.抗除草剂转基因植株的分子验证。分别用PCR和Southern杂交的方法验证抗除草剂植株,并用Southern杂交方法检测外源基因插入的拷贝数。结果表明,每株被测转基因油菜都能扩增到与质粒对照相同的预期条带,而非转基因阴性对照则没有扩增产物。Southern分析显示,转化植株的基因组DNA中均有bar基因插入。5.转基因的遗传和表达。对转基因油菜7个株系自交后代T2、T3进行调查,发现外源基因bar T2代多数株系表现为一对基因的3:1分离,回交后代按1:1分离,与Southern杂交结果一致。T3代可以稳定遗传。正反交结果显示:除草剂抗性表型在供试株系杂种中主要按1:1的比例分离,表明雌蕊原位转化获得的转基因油菜没有细胞质遗传特点。通过构建植物表达载体pGrGUS用于转基因表达的研究发现,甘蓝和甘蓝型油菜转化植株均能够正确表达外源基因GUS。分析转化后的幼嫩种子发现,GUS在种子胚和部分种子的胚乳中均有表达。由于胚和胚乳分别由受精卵和极核细胞发育而来,因此推测受精卵和极核都可能是转化受体,而受精卵更容易被转化。6.雌蕊原位转化法具有物种和品种基因型的非依赖性。依据花粉管生长的特点,将白菜的转化时间调整到授粉后6h,甘蓝及甘蓝型油菜品种的转化时间调整到授粉后15～18h。经除草剂筛选、PCR和Southern鉴定后验证转基因植株。结果表明以中双9号为模式建立起来的雌蕊原位转化体系可适用于2个白菜、2个甘蓝及6个甘蓝型油菜供试品种的基因转化。快生油菜转化率为16.3%,黄籽沙逊转化率为10.3%,绿宝芥蓝为2.7%,甘蓝型油菜品系583为3.1%。7.雌蕊原位转化法创造的突变体。目前从已筛选到的转基因油菜植株及其后代中,发现具有重要农艺性状突变的变异材料,突变包括种子颜色、脂肪酸组成、雄性不育。其中转基因雄性不育突变体油菜05-84,经PCR验证、除草剂涂抹和育性观察,其不育性状与外源bar基因共分离,因此其不育性可能由转基因插入引起。其它突变还包括多个油脂成份改变的突变体、黄籽和叶毛增多等突变体。这些突变体经自交繁殖获得了T2和T3代,突变性状稳定遗传。研究表明本文的转化方法可用于创建突变材料和新种质。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 植物转基因方法与机理研究
• 1.2 转基因突变体的基因克隆
• 1.3 油菜的转基因方法
• 1.4 花粉管通道法转化的研究进展
• 1.5 研究内容
• 1.6 研究目的和意义
• 第二章 油菜雌蕊原位转化体系的建立
• 2.1 植物表达载体的构建
• 2.2 花粉管的观察
• 2.3 雌蕊原位转化和筛选
• 2.4 抗除草剂油菜的PCR 鉴定
• 2.5 雌蕊原位法转化的技术体系
• 2.6 讨论
• 第三章 甘蓝型油菜雌蕊原位转化体系的优化
• 3.1 转化时机的影响
• 3.2 雌蕊切除长度的影响
• 3.3 载体溶剂的影响
• 3.4 优化的转化体系
• 3.5 讨论
• 第四章 转基因油菜的分子检测和遗传分析
• 4.1 抗除草剂油菜的PCR 检测
• 4.2 Southern 杂交检测
• 4.3 报告基因GUS 在转基因油菜中的表达
• 4.4 转基因油菜后代的遗传分析
• 4.5 结论与讨论
• 第五章 雌蕊原位法在其它芸薹属种和油菜品种中的应用
• 5.1 白菜、甘蓝和甘蓝型油菜的花粉管观察
• 5.2 白菜、芥蓝和甘蓝型油菜的雌蕊原位转化和筛选
• 5.3 抗除草剂油菜的PCR 和 GUS 分析
• 5.4 结果与分析
• 5.5 讨论
• 第六章 转基因突变体的研究
• 6.1 材料
• 6.2 方法
• 6.3 雄性不育突变体与共分离研究
• 6.4 其它突变表型
• 6.5 讨论
• 第七章 结论
• 参考文献
• 附录-试剂配方
• 致谢
• 作者简历