论文摘要
内皮素家族包括内皮素-1, 内皮素-2 和内皮素-3。内皮素有很强的血管收缩活性,调节细胞过程:如基因表达、细胞骨架重组、细胞分化、生长,促进神经多肽, 激素释放。 内皮素与特定的 G 蛋白偶联受体(GPCRs)相互作用, 包括内皮素 A 与 B 受体(ETAR 和 ETBR) 两个亚型。 G 蛋白偶联受体(GPCRs)是与信号传导关联最大的一族细胞表面分子, 然而对于受体下游信号的机理尚不清楚。最近研究表明组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltransferase) Tip60 和组蛋白脱羧酶(thehistone deacetylase) HDAC7 与 ET 的一个受体(ETAR)存在相互作用。为了初步阐明(1)与 ET 两个受体(ETAR and ETBR)相互作用的新蛋白分子及(2)研究它们的相互作用, 从而为 ET 受体下游信号途径的研究提供新的线索,本研究设计了从人婴儿脑 cDNA 库筛选与 ETAR 和 ETBR 相互作用的新的蛋白分子;通过 GSTpull-down assay 和免疫共沉降实验(co-immunoprecipitation)探讨 ETAR 和ETBR 与未知蛋白分子的相互作用。通过该研究可达到发现新的与 ETAR 和 ETBR 相互作用的蛋白分子,从而阐明其对下游信号调节的作用的目的。我们的研究分为两大部分。 1.酵母杂交筛选(Yeast two hybrid screening) 我们用 ETAR 和 ETBR C 末端作为 bait 通过酵母杂交系统从人婴儿脑 cDNA 库筛选与其相互作用的分子。通过 X-Gal 实验进一步证明在受体与检测出的分子之间的相互作用。结果表明在酵母细胞水平, 在包含 5×107个分子的人婴儿脑 cDNA库中大约分别有 6.4×105 和 2.75×106个克隆与 ETAR 和 ETBR C 末端相互作用。在 X-Gal 实验中, ETAR 的 90 个候选克隆与 ETBR 的 279 个候选克隆变成蓝色, 而其他克隆则没有发生颜色变化, 这些变成蓝色的克隆是酵母杂交实验的阳性克隆,以阳性克隆质粒为模板进行 PCR 扩增, 然后对 PCR 产物进行测序, 测得序列
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