贵州新城疫分子流行病学调查及荧光RT-PCR方法的检测

论文摘要

新城疫（Newcastle Disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle Disease Virus,NDV）引起的极易传染的毁灭性疾病。NDV属于副粘病毒科,副粘病毒亚科,腮腺炎病毒属。由于该病发病急、致死率高,对养禽业的发展构成了严重威胁,所以被世界动物卫生组织（OIE）定为A类烈性传染病。长期以来,我国普遍开展了以接种疫苗为主的新城疫综合防制措施,使得ND的暴发得以控制,但近年来,ND的流行又出现新的特点:不表现特异性症状的ND病例日益增多,甚至于高抗体鸡群也发生该病;许多学者认为这些流行特点表明很可能是由变异或超强毒株引起。特别是近年来鹅源病毒新城疫变异株的出现,更引起人们对于非典型新城疫发病原因的兴趣。本研究通过RT-PCR法对1999至2004年间分离自贵州省的具有一定代表性的8株新城疫病毒。扩增出其F基因,并与国内外已发表各新城疫代表株进行同源性比较。为探讨新城疫是否发生变异提供理论依据。为贵州省的NDV分子流行病学研究提供有益参考,丰富我国新城疫分子流行病学特征,为制定控制新城疫方法提供重要依据。目前检测NDV的方法有血凝和血凝抑制试验、病毒分离法、免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验等。这些方法有的存在费时、有的存在敏感性不高或特异性不强等缺点。而普通RT-PCR方法可以快速和特异性地检测很少拷贝的NDV的核酸,因此可以用于NDV的检测。但其难以控制核酸污染造成假阳性,荧光RT-PCR是近几年才发展起来的一项新技术。它既具有普通RT-PCR的高度灵敏性,又具有实时、快速、能够避免核酸污染和化学物污染等优点。SYBRGreenⅠ模式的荧光RT-PCR是利用荧光染料SYBR GreenⅠ与DNA双链结合后释放荧光的特点而建立的一种应用较广的荧光PCR技术。SYBR GreenⅠ模式的荧光RT-PCR的优点是成本小,不需设计探针,只要有相关的引物就可以进行实时检测,并且适合于高度变异的基因检测。本研究建立了NDV和其毒力的SYBR GreenⅠ模式的荧光RT-PCR检测技术。本课题分三部分进行研究。第一部分:新城疫病毒贵州分离株F基因的克隆和序列分析根据GenBank中登录的新城疫病毒（NDV）F基因序列设计了1对引物,用RT—PCR方法扩增了8个贵州分离株的F基因片段,并将其分别克隆到pMD-18T载体中。序列分析结果表明,上述分离株F基因长度为1662bp,编码553个氨基酸,核苷酸和氨基酸序列同源性分别为84.0%～99.7%和87.5%～99.3%;但与LaSota、B1及F48E9等常见毒株的氨基酸同源性仅为87.2%～97.7%。F蛋白裂解位点的氨基酸序列分别为112R—R—Q—R/K—R—F117(其中P1、H2、、N98、DQ、FW、BY、GZ 7株为强毒)和112G—R—Q—G—R—L117（TN1株为弱毒）。利用MegAlign软件绘制NDV的系统发育进化树,结果表明:4株分离株(P1、H2、、N98、DQ)为基因Ⅶ型,2株（GZ、TN）为基因Ⅱ型,2株（FW、BY）为基因Ⅸ型。第二部分:SYBR GreenⅠ荧光RT-PCR方法快速鉴定新城疫病毒毒力为建立快速鉴定新城疫病毒毒力的SYBR GreenⅠ荧光RT-PCR方法,根据NDV的F蛋白裂解位点附近的序列,自行设计一对引物,然后根据SYBR GreenⅠ模式的荧光RT-PCR方法对8株NDV的RNA扩增效率以及扩增产物的Tm值的大小来区分NDV的毒力。同时对8株NDV进行鸡胚平均致死时间（MDT）测定和序列测序测定,实验表明:荧光RT-PCR方法的检测结果和MDT测定的结果以及序列测序测定的结果完全一致。三种方法同时对80份受检组织样品进行检测,检测结果为:SYBR GreenⅠ模式的荧光RT-PCR方法检出率为:强毒:53.75%（43/80）、弱毒:31.25%（25/80）;普通RT-PCR方法检出率为:强毒:53.75%（43/80）、弱毒:27.50%（22/80）;鸡胚接种病毒分离法检出率为:强毒:53.75%（43/80）、弱毒:35.00%（28/80）。整个检测过程只需4h,表明该方法特异、准确、快速。说明此荧光RT-PCR法可用于NDV毒力检测。第三部分:荧光定量RT-PCR检测雏鸡体内新城疫强毒的分布规律新城疫病毒（NDV）强毒H2经人工接种和同居感染18日龄雏鸡后,应用实时荧光定量RT-PCR检测病毒在雏鸡体内各组织的动态分布。实验结果表明:（1）经滴鼻、点眼接种雏鸡后6h,即可在肺、脑、脾、肾、肠共五种组织中检出NDV的RNA;12h后所有受检组织器官均可检测到NDV的RNA。（2）同居混群感染后6h,未能在各种组织中检出NDV的RNA,12h后可在肺、脑、脾、肾、肠、肝、共六种组织中检出NDV的RNA。24h所有受检组织均能检出NDV的RNA。（3）在以上2种感染途径中,各受检组织的病毒含量从高到低依次为:肺、脑、脾、肾、肠、肝、心脏、腿肌。同时做荧光RT-PCR和普通RT-PCR的灵敏度比较试验。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 试验一 新城疫病毒贵州分离株F基因的克隆和序列分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 SPF鸡胚
• 1.1.2 菌株与质粒载体
• 1.1.3 病毒来源
• 1.1.4 主要试剂
• 1.1.5 溶液配制
• 1.1.6 主要仪器和设备
• 1.2 方法
• 1.2.1 病毒扩增
• 1.2.2 致病性试验
• 1.2.3 NDV病毒核酸RNA的提取（Trizol法）
• 1.2.4 引物设计
• 1.2.5 RT-PCR扩增F基因片断
• 1.2.6 琼脂糖凝胶电泳分析
• 1.2.7 PCR产物的回收
• 1.2.8 NDV F基因的克隆与鉴定
• 2 结果
• 2.1 NDV分离株的致病性
• 2.2 RT-PCR扩增F基因
• 2.3 F基因片断的克隆与鉴定
• 2.4 NDV F基因核苷酸序列和氨基酸序列
• 2.5 NDV的系统进化发生树
• 3 讨论
• 试验二 SYBR GREEN Ⅰ荧光RT-PCR方法快速鉴定新城疫病毒毒力
• 1 材料与方法
• 1.1 毒株、样品、试剂和仪器
• 1.2 病毒RNA的提取
• 1.3 引物设计与合成
• 1.4 荧光RT-PCR检测
• 1.5 检测结果判断
• 1.6 与其他方法比较
• 1.7 受检组织的检测
• 2 结果与分析
• 2.1 荧光RT-PCR检测
• 2.2 MDT和序列的测定
• 2.3 受检组织的检测
• 3 讨论
• 试验三 荧光定量RT-PCR检测雏鸡体内新城疫强毒的分布规律
• 1 材料与方法
• 1.1 毒株、试验鸡、试剂和仪器
• 1.2 试验设计
• 1.3 病料组织处理及病毒RNA的提取
• 1.4 PCR引物设计与合成
• 1.5 标准曲线的建立
• 1.6 RT-PCR扩增
• 1.7 灵敏度和重复性比较试验
• 2 结果
• 2.1 肉鸡感染试验结果
• 2.2 标准曲线的绘制
• 2.3 组织含毒量的检测
• 2.4 灵敏度和重复性
• 3 小结与讨论
• 文献综述-新城疫研究进展
• 参考文献
• 附录一 攻读硕士学位期间参与发表的论文
• 附录二 各种操作方法步骤及溶液、试剂、培养基的配制
• 附录三 缩略语英汉对照表
• 致谢