干旱胁迫下斑茅全长cDNA文库的构建及hir基因功能的初步分析

论文摘要

甘蔗是我国乃至是全世界最重要的糖料作物。但甘蔗的种植区由原来水分充足的地区逐渐转移到了比较贫瘠甚至缺水少肥的旱坡地,这就迫使甘蔗育种要向培育抗旱耐瘠以及宿根性强的品种方向发展。斑茅（Erianthus arundinaceus）是甘蔗近缘属植物,生长势强,抗旱耐瘠,宿根性好,是甘蔗育种的重要基因资源。本论文利用斑茅为材料,在干旱胁迫下用SMART方法构建其全长cDNA文库,从中随机挑取克隆进行测序。在这些克隆中得到hir基因,其有完整的5′和3′末端,有一个855bp的CDS,对该基因进行生物信息学分析后,推测与斑茅的抗旱性有关。在设计引物对该基因做了实时荧光定量PCR分析后,发现其表达量随着干旱胁迫的程度而增强,当斑茅在40%PEG6000胁迫处理72hr后其表达量达到正常时的48.17倍。因此,构建了以pCRBI载体为骨架,由Prd29A启动子驱动的环境诱导型载体pRD-HIR,并通过农杆菌转化拟南芥,用草甘膦筛选得到阳性植株,并作PCR检测,证明外源基因已经成功整合到拟南芥基因组中,获得转基因拟南芥。同时,根据该基因的DNA序列,设计合成RNAi引物,通过PCR扩增出该基因片段（320bp）,将该片段正反向连接于载体pTCK-303载体中,构建成RNAi表达载体pTCK-HIR,以进一步证实这个基因与抗旱的关系。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1.引言
• 1.1 斑茅对甘蔗抗旱育种的意义
• 1.2 干旱对农作物生长的影响
• 1.2.1 干早胁迫对植物的伤害
• 1.2.1.1 植物生长受到抑制
• 1.2.1.2 消弱植物的光合作用
• 1.2.1.3 活性氧对植物的氧化伤害
• 1.2.2 植物耐旱性的生物学机理
• 1.2.2.1 通过调整气孔开闭来防止水分散失
• 1.2.2.2 渗透调节
• 1.2.2.3 抗氧化防御系统
• 1.2.2.4 脱落酸作用
• 1.2.2.5 Lea蛋白的保护作用
• 1.2.2.6 水通道蛋白在农作物抗旱机制中的作用
• 1.2.3 植物水分胁迫的分子响应
• 1.2.3.1 水分胁迫的信号感知
• 1.2.3.2 水分胁迫的信号传导
• 1.2.3.3 水分胁迫的基因表达
• 1.3 抗旱基因的分离克隆策略
• 1.3.1 基于基因的DNA序列分离基因的方法
• 1.3.2 基于基因功能的分离方法
• 1.3.3 从基因转录产物分离
• 1.3.4 基于基因翻译产物的方法
• 1.4 全长cDNA文库构建方法的研究进展
• 1.4.1 Oligo-Capping方法（Oligo-Capping Method）
• 1.4.2 CAPture法（CAPture Method）
• 1.4.3 SMART法(Switching Mechanism At5'end of RNA Transcript methodl
• 1.4.4 CAP-Trapper法（CAP-Trapper Method）
• 1.4.5 CAP-Jumping法
• 1.5 本研究的目的意义,研究内容和技术路线
• 2.材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 主要试剂和试剂盒
• 2.1.4 所用质粒载体、引物、细菌
• 2.1.4.1 质粒载体
• 2.1.4.2 引物
• 2.1.4.3 所用细菌
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 斑茅抗旱全长cDNA文库的构建
• 2.2.1.1 斑茅的干旱处理
• 2.2.1.2 总RNA的提取和mRNA的纯化
• 2.2.1.3 全长cDNA第一链的合成
• 2.2.1.4 全长cDNA第二链的合成
• 2.2.1.5 分段切取ds cDNA片段
• 2.2.1.6 与T-Vector连接和转化
• 2.2.1.7 文库滴定、重组率测定
• 2.2.1.8 cDNA文库质量鉴定
• 2.2.1.9 选取个别片段的菌落进行测序
• 2.2.2 渗透胁迫下HIR基因的荧光实时定量分析
• 2.2.2.1 斑茅叶片总RNA制备以及纯度、完整性鉴定
• 2.2.2.2 cDNA合成
• 2.2.2.3 FQ-PCR（两步法PCR扩增）
• 2.2.3 构建载体
• 2.2.3.1 构建环境诱导型表达载体
• 2.2.3.2 构建RNAi载体
• 2.2.4 转化:
• 2.2.4.1 将环境诱导型载体转入农杆菌
• 2.2.4.2 转化拟南芥
• 2.2.4.3 用草甘膦进行筛选
• 2.2.4.4 对阳性转化植株提取DNA做PCR验证
• 3.结果与分析
• 3.1 斑茅全长cDNA文库的构建
• 3.1.1 总RNA的制备
• 3.1.2 全长cDNA第一链的合成
• 3.1.3 全长cDNA第二链的合成
• 3.1.4 cDNA文库的构建和质量鉴定
• 3.1.5 全长文库部分克隆的测序分析
• 3.2 HIR全长基因的分析
• 3.2.1 基因的预测
• 3.2.2 荧光定量实时PCR分析
• 3.3 HIR基因功能的初步分析
• 3.3.1 环境诱导型载体构建
• 3.3.1.1 HIR基因的扩增
• 3.3.1.2 目的基因与环境诱导型载体pCRBI连接
• 3.3.1.3 连接产物转入农杆菌
• 3.3.2 转化
• 3.3.3 RNAi载体构建
• 3.3.3.1 正向片段的连入
• 3.3.3.2 反向片段的连入
• 4.讨论
• 4.1 RNA提取
• 4.2 双链cDNA合成
• 4.3 HIR基因在作物抗旱中的作用
• 5.结论与展望
• 参考文献
• 附录
• 附录1:文库测序结果举例
• 附录2:所用分子生物学实验方法
• 1.大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.大肠杆菌细胞的热激法转化
• 3.根癌农杆菌感受态细胞制备
• 4.农杆菌细胞的冻融法转化
• 5.CTAB提取拟南芥基因组DNA
• 6.LB培养基
• 7.YEB培养基
• 附录3:缩写词
• 在学期间发表的论文
• 致谢