论文摘要
禽传染性支气管炎（Avian Infectious Bronchitis，IB）是由禽传染性支气管炎病毒（IBV）引起的鸡的一种急性、高度接触性的传染病。IBV的变异大，血清型多，是IB免疫预防的一大难题。IBVM蛋白比较保守，在病毒粒子中所占的比例最大，同时具有膜蛋白的典型特点，是重要的免疫原基因。M蛋白的这些特性为M蛋白作为IB的诊断抗原提供了重要的分子生物学及免疫学依据。本研究根据本课题组在GenBank中注册的禽传染性支气管炎病毒中国分离株SAIBK株的M基因序列（注册号AY302742）及毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K的序列设计引物，通过鸡胚培养收获禽传染性支气管炎病毒，提取病毒RNA，用RT-PCR方法扩增出IBV M基因，构建了克隆载体pMD18-M，通过菌落PCR和酶切对克隆载体进行了鉴定。将克隆载体pMD18-M和酵母表达载体pPIC9K分别用限制性内切酶EcoR I和Not I进行双酶切，回收目的片段，用T4 DNA连接酶将两者连接后转化大肠杆菌，筛选得到酵母表达载体，经酶切鉴定M基因已经正确地连接到pPIC9K上。用限制性内切酶Sac I将表达质粒pPIC9K-M线性化，然后用电转化的方法导入毕赤酵母GS115中。将在MD平板上生长的转化子经过PCR鉴定、表型筛选和不同G418抗性浓度筛选后，获得整合型阳性重组菌株，命名为GS115／pPIC9K-MHis+Mut+。将重组菌株在1％的甲醇中进行诱导分泌表达，通过收集不同时间段的表达产物进行SDS-PAGE分析表明，在诱导72小时后目的蛋白表达量最大，表达蛋白占上清中总蛋白量的13.3％，表达蛋白的分子量约为33KD。通过Western-blot检测显示，表达蛋白能与IBV阳性血清特异性结合。对表达蛋白进行初步纯化后，以M蛋白为包被抗原的ELISA检测结果显示表达蛋白与特异性抗体反应良好，表明表达的M蛋白生物学活性良好。目前国内外还没有利用毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K来表达IBV M蛋白的报道。本研究表达的IBV M蛋白可作为制备IB诊断抗原的基础材料，对IB的防治有重要理论和实用价值。
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标签：禽传染性支气管炎病毒论文; 基因论文; 毕赤酵母论文; 分泌表达论文;