论文摘要
【研究背景和目的]胆管癌（Cholangiocarcinoma）是起源于胆道上皮细胞的恶性肿瘤。流行病学显示近年来胆管癌的发病率明显升高。从解剖学上来分,胆管癌分为肝内胆管癌和肝外胆管癌。根治性手术切除仍是胆管癌最有效的治疗方式,但由于胆管癌生长部位特殊,起病隐匿,发展迅速,早期缺乏特异性症状和体征,易早期转移,确诊时多已属中晚期,失去了手术机会,故预后很差。只有少部分病人具有手术切除的条件,但手术后复发率较高。此外,胆管癌对放疗和化疗敏感性较差。研究胆管癌早期诊断及影响预后的分子生物学标志,并探讨其影响胆管癌的侵袭转移的机制,可以为胆管癌的治疗提供新的潜在治疗靶点。S100A4属于钙结合蛋白S100蛋白家族。已证实,该家族与肿瘤的侵袭转移密切相关。在食管癌、胃癌、胰腺癌、肝癌等多种消化系统肿瘤组织中均可检测到S100A4的表达。S100A4的过表达与肿瘤的淋巴结转移、血管浸润、分化程度、TNM分期等相关,可以作为独立的评价肿瘤预后的一个因子。研究表明,S100A4通过增强细胞运动性、促进细胞外基质降解、降低细胞粘附力、促进血管生成、促进细胞凋亡等机制促进肿瘤细胞的侵袭和转移。目前,国内外研究S100A4在胆管癌组织中表达情况的报道极少,其在胆管癌的发生发展中的作用尚不清楚。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs）是一类锌离子依赖的蛋白水解酶,在细胞外基质的降解中发挥关键作用。S100A4与基质金属蛋白酶家族的关系密切,研究表明,S100A4可以通过调节不同的基质金属蛋白酶而促进肿瘤的发展。本研究通过免疫组织化学方法检测S100A4、MMP-9在肝内、肝外胆管癌原发灶及癌旁组织中的表达情况,并分析S100A4、MMP-9的表达相关性与胆管癌的临床病理特征的关系。在体外研究中,合成针对S100A4基因的小干扰RNA （small interfering RNA, siRNA）转染抑制肝内胆管癌细胞株HCCC-9810细胞中S100A4的表达,观察干扰S100A4基因表达后对HCCC-9810细胞的增殖、侵袭转移以及多种基质金属蛋白酶表达的影响,从而探讨S100A4对胆管癌细胞生物学功能的影响及其可能机制。【方法】1. S100A4、MMP-9在胆管癌中表达的检测及临床意义评价：选取山东省立医院病理科存档且临床病理资料完整的76例胆管癌原发灶组织及癌旁组织,其中,44例肝内胆管癌,32例肝外胆管癌。应用免疫组织化学方法检测S100A4、MMP-9的表达,分析S100A4的表达与胆管癌患者临床病理特征的关系。2.胆管癌细胞株HCCC-9810中S100A4表达的检测：应用免疫细胞化学、RT-PCR、Western blot的方法从基因和蛋白水平上检测HCCC-9810中S100A4的表达。3.化学合成S100A4 siRNA转染HCCC-9810细胞及最佳干扰片段的筛选：体外化学方法合成三条S100A4 siRNA及阴性对照siRNA。通过脂质体Lipofectamine2000将siRNA转染入HCCC-9810细胞,采用实时荧光定量PCR. Western blot分别检测转染后HCCC-9810中S100A4基因和蛋白的表达情况,筛选出沉默效率最高的干扰片段。4.S100A4对HCCC-9810细胞侵袭转移能力的影响及机制探讨：将筛选出的最佳S100A4 siRNA干扰片段转染HCCC-9810细胞,沉默HCCC-9810中S100A4的表达,通过四唑盐比色法（MTT）检测S100A4干扰后对HCCC-9810细胞增殖能力的影响；通过细胞划痕实验检测S100A4干扰前后细胞迁移能力变化；通过Transwell体外侵袭实验检测S100A4干扰对细胞侵袭能力的影响。实时荧光定量PCR和Western blot方法检测S100A4 siRNA转染后MMP-2, MMP-7, MMP-9, MMP-13的表达变化,探讨S100A4促进侵袭转移的可能机制。【结果】1. S100A4、MMP-9在胆管癌组织中的表达和临床病理意义：应用免疫组化方法分别检测S100A4、MMP-9在肝内胆管癌和肝外胆管癌组织中的表达。44例肝内胆管癌组织中,有18例（40.9%）S100A4阳性表达,23例（52.3%）MMP-9阳性表达。32例肝外胆管癌组织中,有17例（53.1%）S100A4阳性表达,19例（59.4%）MMP-9阳性表达。S100A4和MMP-9在肝内及肝外胆管癌组织中的表达都有明显的相关性（P=0.027）。S100A4的表达与肝内胆管癌患者的肿瘤淋巴结转移有明显相关性（P=0.031）,与肝外胆管癌患者的淋巴结转移也有一定的相关趋势（P=0.060）。2.胆管癌细胞株HCCC-9810中S100A4表达的检测：应用免疫细胞化学、RT-PCR、Western blot的方法从基因和蛋白水平上证实HCCC-9810中S100A4高表达。3. S100A4 siRNA最佳干扰片段的筛选：通过脂质体Lipofectamine2000分别将3条S100A4 siRNA（分别编号为siRNA 1,2,3）和阴性对照siRNA转染入HCCC-9810细胞。实时荧光定量PCR和Western blot检测干扰效果。实时荧光定量PCR结果显示,S100A4 siRNA-1,2,3组中S100A4mRNA相对表达量分别为空白对照组的56.5%,21.3%和13.1%,差别有显著差异（P<0.05）。Western blot结果显示,S100A4 siRNA-2和S100A4 siRNA-3组S100A4蛋白相对表达水平与空白对照HCCC-9810细胞组相比明显下降,有显著性差异（P<0.05）,其中,又以S100A4siRNA-3片段效果最好,而S100A4 siRNA-1组干扰效果相对较弱（P>0.05）。综合实时荧光定量RT-PCR和Western blot结果,3组干扰片段中,S100A4 siRNA-3的干扰效果最高。因此,选用S100A4siRNA-3干扰片段进行后续实验,验证S100A4对HCCC-9810细胞侵袭转移能力的影响。4.S100A4对HCCC-9810细胞增殖和侵袭转移能力的影响及机制探讨：1)干扰S100A4表达不影响HCCC-9810细胞的增殖能力：MTT实验显示,S100A4siRNA转染后对HCCC-9810细胞的增殖影响不明显,与转染阴性对照siRNA组、脂质体对照组和空白对照组相比无明显差异（P>0.05）。2)干扰S100A4表达抑制HCCC-9810细胞的迁移：在划痕24h后,S100A4 siRNA组、阴性对照siRNA组、空白对照组划痕区域的相对宽度分别为（77.91±8.41）%、（60.90±8.13）%和（56.24±7.34）%。在划痕48h后,相应组别的相对宽度分别为（61.63±7.49）%、（23.10±8.41）%和（20.50±5.04）%。与空白对照组相比,S100A4siRNA组在24h和48h两个时间点的划痕的区域都明显较宽,差别有统计意义（P<0.01）。3)干扰S100A4表达抑制HCCC-9810细胞的侵袭：Transwell体外侵袭实验显示,在细胞接种24h后,空白对照组、阴性对照组、S100A4 siRNA组的穿膜细胞数分别为（67.6±13.27）个/HP、（61.3±13.20）个/HP、（33.8±8.41）个/HP。与空白对照组和阴性对照组相比,S100A4siRNA组的穿膜细胞数明显减少,差异有显著性（P<0.01）。4)干扰S100A4表达抑制HCCC-9810细胞中MMP-9的表达：实时荧光定量RT-PCR显示,S100A4siRNA转染后,HCCC-9810细胞中MMP-9 mRNA的表达与siRNA阴性对照组、脂质体对照组和空白对照组相比表达明显降低,差别有统计学意义（P<0.05）。而MMP-2, MMP-7,MMP-13mRNA的表达无明显差异（P>0.05）。Western blot结果进一步证实,S100A4 siRNA转染组细胞中MMP-9的表达降低。【结论】1. S100A4、MMP-9在肝内和肝外胆管癌组织中都有高表达,二者在肝内和肝外胆管癌组织中的表达具有明显相关性。2. S100A4过表达与肝内胆管癌的淋巴结转移相关,与肝外胆管癌的淋巴结转移也有相关趋势,提示S100A4可能参与胆管癌的侵袭转移。3. S100A4 siRNA能有效抑制HCCC-9810细胞中S100A4表达,同时能够导致HCCC-9810细胞的迁移和侵袭能力下降,以及MMP-9的表达下调,而细胞增殖能力无变化,提示S100A4可能通过促进MMP-9的表达而增强胆管癌细胞的侵袭转移能力。4. S100A4在胆管癌细胞侵袭转移中起着重要作用,有可能成为胆管癌治疗的一个潜在治疗靶点。