小麦苗期磷胁迫诱导紫色酸性磷酸酶基因和转录因子基因cDNA片段的克隆与分析

论文摘要

磷是植物生长发育必需的大量元素之一。它不仅是植物细胞的结构成分，而且在细胞的代谢调控及信号转导中起重要作用。土壤中磷的总含量非常丰富，但有效磷浓度极低。因此，借助现代分子生物学手段，筛选和利用低磷胁迫响应关键基因进行小麦磷高效基因型的遗传改良，是实现磷资源可持续利用的必然途径。本研究利用室内水培方法进行小麦苗期磷胁迫实验，利用比较基因组学的方法筛选小麦磷胁迫诱导表达的紫色酸性磷酸酶基因和转录因子基因，并进行了初步表达分析，主要结果如下：1.小麦磷胁迫诱导酸性磷酸酶基因cDNA片段克隆与表达分析根据同源克隆的方法，得到了1个新的紫色酸性磷酸酶基因cDNA片段，命名为：TaPAP-like1。对TaPAP-like1及已发表的AtPAP1的同源基因AK334325.1的半定量RT-PCR分析结果表明：与拟南芥紫色酸性磷酸酶AtPAP12类似，TaPAP-like1是磷饥饿诱导增强表达型，即在P+条件下，细胞中就有基因转录产物存在，随着磷胁迫时间延长，其转录产物明显增加；TaPAP-like1和AK334325.1在地上部和根系中均有诱导表达。但是，随着磷胁迫时间延长，TaPAP-like1仍持续性诱导表达，而AK334325.1却在磷胁迫7d后表达量有所下降。说明在磷饥饿后期，小麦植株启动了其它拯救机制应答磷胁迫。2.小麦磷调控转录因子基因cDNA片段克隆与表达分析根据同源克隆的方法，得到了3个磷调控MYB家族类似转录因子基因cDNA片段，分别命名为：TaMYB-like1，TaMYB-like2，TaMYB-like3。半定量RT-PCR分析表明：随磷胁迫时间的延长，TaMYB-like1在根系中出现诱导表达，但地上部无诱导效应；而其原参照基因OsPHR2在植株的各组织都有表达，但在根和叶中表达比较强烈。而且它在磷饥饿7d时仍不受磷饥饿的诱导；TaMYB-like2在磷胁迫4d时，地上部有微弱诱导，但根部不显著；而其原参照基因At3g25790受磷缺乏的强烈诱导。TaMYB-like3对磷胁迫的转录水平反应在根系及地上部均不显著；而其原参照基因AtMYB62在磷饥饿的叶中诱导表达。本研究运用比较基因组学的方法获得的小麦磷调控基因与原参照基因的表达模式并不完全相同，对其基因功能的深入研究可望为揭示小麦磷调控网络提供线索。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 1 文献综述
• 1.1 植物低磷胁迫研究进展
• 1.1.1 植物磷营养研究
• 1.1.1.1 植物磷营养的生理功能
• 1.1.1.2 土壤中及植物体内磷素存在的形态及分布情况
• 1.1.2 植物磷营养效率的研究
• 1.1.2.1 磷营养效率概念
• 1.1.2.2 植物磷营养效率基因型差异
• 1.1.2.3 植物磷营养效率与磷高效基因型
• 1.1.2.4 小麦磷营养效率评价指标
• 1.2 植物对磷饥饿的自我拯救机制
• 1.2.1 磷胁迫下植物根系形态的变化
• 1.2.2 磷胁迫下植物生理生化上的变化
• 1.2.2.1 有机酸和质子的分泌
• 1.2.2.2 磷酸酶和核糖核酸酶的分泌
• 1.2.3 植物适应低磷胁迫的分子生物学机制
• 1.2.3.1 磷转运蛋白基因
• 1.2.3.2 酸性磷酸酶基因
• 1.2.3.3 低磷胁迫相关转录因子
• 1.3 克隆小麦基因常用的方法
• 1.3.1 同源克隆
• 1.3.2 抑制性差减杂交技术
• 1.3.3 mRNA 差异显示技术
• 1.4 实现小麦生产的可持续高产稳产面临的“磷危机”与发展途径
• 2 引言
• 3 小麦紫色酸性磷酸酶基因的cDNA片段克隆
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 磷胁迫水培试验
• 3.1.3 磷胁迫诱导紫色酸性磷酸酶同源基因搜索及简并引物设计
• 3.1.4 Trizol 法提取小麦叶片总RNA 及总RNA 的纯化
• 3.1.5 cDNA 第一条链的合成
• 3.1.6 RT-PCR 扩增
• 3.1.7 RT-PCR 产物的克隆及测序
• 3.1.7.1 RT-PCR 产物的回收
• 3.1.7.2 目的DNA 片段与载体的连接
• 3.1.7.3 CaCl2 法制备DH5α感受态细胞
• 3.1.7.4 重组DNA 热激转化大肠杆菌DH5α
• 3.1.7.5 重组转化子的鉴定及测序
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 筛选出的简并引物
• 3.2.2 小麦总RNA 检测
• 3.2.3 小麦内参基因扩增
• 3.2.4 RT-PCR 产物电泳检测及cDNA 片段序列相似性分析
• 4 小麦磷调控转录因子基因的cDNA片段克隆
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料和磷胁迫水培试验
• 4.1.2 磷调控转录因子同源基因搜索及简并引物设计
• 4.1.3 RT-PCR 扩增及RT-PCR 产物克隆测序
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 筛选出的简并引物
• 4.2.2 小麦总RNA 检测及内参基因扩增
• 4.2.3 RT-PCR 产物电泳检测和cDNA 片段序列相似性分析
• 5 候选小麦磷胁迫诱导基因的表达模式分析
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 小麦材料的培养
• 5.1.2.1 0d-8d 缺磷处理
• 5.1.2.2 7d-28d 缺磷处理
• 5.1.3 半定量RT-PCR 引物设计
• 5.1.4 RNA 提取和纯化及反转录cDNA 第一链
• 5.1.5 半定量RT-PCR
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 小麦总RNA 检测
• 5.2.2 半定量RT-PCR 引物设计
• 5.2.3 半定量RT-PCR 产物电泳检测
• 8d 缺磷处理'>5.2.3.1 0d⁸d 缺磷处理
• 28d 缺磷处理：'>5.2.3.2 7d²8d 缺磷处理：
• 6 结论与讨论
• 6.1 小麦磷胁迫诱导酸性磷酸酶基因cDNA 片段克隆与表达分析
• 6.2 小麦磷调控转录因子基因cDNA 片段克隆与表达分析
• ABSTRACT
• 参考文献
• 附录
• 1 实验中用到的仪器、主要酶类及试剂等
• 1.1 仪器
• 1.2 实验中用到的主要酶类
• 1.3 实验中用到的主要试剂以及部分溶液和培养基的配制方法
• 1.3.1 主要的试剂
• 1.3.2 部分试剂、缓冲液和常用培养基的配制方法
• 2 测序cDNA 片段的序列