苯巴比妥残留免疫学快速检测技术研究

论文摘要

苯巴比妥（Phenobarbital,PB）具有镇静、催眠、麻醉、抗惊厥、抗癫痫等药效作用,临床上主要用于治疗焦虑、失眠、癫痫发作、高胆红素血症等疾病。由于PB的镇静、催眠特殊生物学作用,常被用作饲料添加剂。但PB对人体具有致畸、致癌等毒性作用,世界各国均规定食品动物生产中不得使用PB,动物性食品中不得检出PB。免疫学分析技术以其灵敏、特异、快速、简便等优点在药物残留检测领域已被广泛应用,替代了理化检验方法,美国和德国已研制出PB残留免疫学检测产品,国内尚属空白。本研究对PB的免疫原性、人工抗原合成、多克隆抗体（pAb）和单克隆抗体（mAb）制备及其特性、试剂盒研制及其性能、免疫金标试纸研制及其性能、气-质联用（GC-MS）对试剂盒和免疫金标试纸的确证等进行了研究。在分析PB分子结构和免疫原性基础上,将PB经过硝化和还原两步化学修饰在其苯环上引入活性基团氨基,合成具有半抗原结构特征的对氨基苯巴比妥（pAPB）,用重氮化法将pAPB偶联于牛血清白蛋白（BSA）和鸡卵清蛋白（OVA）,合成人工免疫原BSA-pAPB和包被抗原OVA-pAPB,通过红外（IR）、紫外（UV）、SDS-PAGE和免疫小鼠后抗血清的ELISA鉴定,BSA-pAPB偶联成功,分子结合比为1∶19,获得了高价、敏感、特异的抗血清。用BSA-pAPB免疫新西兰白兔5只,8次免疫后获得了PB pAb,经鉴定,其间接ELISA效价为1∶6.4×105,阻断ELISA测定半数抑制浓度（IC50）为14.8μg/L,与巴比妥的交叉反应率（CR%）为9.7%,与其它化合物无CR,琼脂双扩散实验结果表明产生了针对pAPB的特异性抗体,WestGold实验结果表明与PB特异性结合。用BSA-pAPB免疫Balb/C小鼠5只,5次免疫后用间接ELISA和阻断ELISA选择出细胞融合备用小鼠1只,应用细胞融合技术筛选出1B9、3C4、3F6、4E6共4株敏感特异的杂交瘤细胞,用体内诱生腹水法制备PB mAb,经鉴定,其间接ELISA效价细胞培养上清分别为1∶2.7×102、1∶5.12×102、1∶3.2×102、1∶8.1×102,腹水分别为1∶2.56×105、1∶5.12×104、1∶3.2×105、1∶6.4×105,同种型分别为IgG2a/κ、IgG2a/λ、IgG1/κ、IgG1/κ,亲和常数（Ka）分别为2.55×109、1.03×1010、3.76×109、2.08×1010（L/mol）,其中亲和力最高的4E6株阻断ELISA测定其IC50为11.35μg/L,与巴比妥的CR%为8.4%,与其他化合物无CR,WestGold实验结果表明与PB特异性结合。本实验制备的PB pAb和PB mAb均可用于PB残留检测的免疫学试验,PB mAb更好。应用PB mAb研制出PB残留快速检测阻断ELISA和竞争ELISA试剂盒（PB-Kit）,其中竞争ELISA试剂盒的质量性能更好,PB-Kit的标准曲线呈S型,符合4参数logit

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 苯巴比妥残留检测研究进展
• 1.1 苯巴比妥的理化特性及临床应用
• 1.1.1 PB 的化学结构、理化特性与构效关系
• 1.1.2 PB 的药理作用与药动学特性
• 1.1.3 PB 的临床应用
• 1.2 苯巴比妥在动物生产中的非法使用及安全性评价
• 1.2.1 PB 的非法使用
• 1.2.2 PB 的毒性作用
• 1.2.3 PB 中毒的临床症状
• 1.2.4 我国政府对PB 非法使用的综合治理
• 1.3 动物性食品中苯巴比妥残留检测研究进展
• 1.3.1 理化分析法
• 1.3.2 免疫学分析法
• 1.4 本研究的目的及意义
• 1.5 本研究的主要内容和技术路线
• 第二章 苯巴比妥人工抗原的合成与鉴定
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 人工抗原的鉴定
• 2.2.2 PB pAb 鉴定
• 2.3 讨论
• 2.3.1 关于 PB 半抗原的设计
• 2.3.2 关于 PB 人工抗原的制备方法
• 2.3.3 关于 PB 人工抗原的免疫原性
• 2.3.4 关于 PB 人工抗原的鉴定方法
• 2.4 小结
• 第三章 苯巴比妥抗体的制备及其免疫学特性鉴定
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 PB pAb 的免疫学特性鉴定
• 3.2.2 PB mAb 杂交瘤细胞株的建立
• 3.2.3 PB mAb 的免疫学特性鉴定
• 3.3 讨论
• 3.3.1 关于 PB pAb 的免疫学特性鉴定
• 3.3.2 关于 Balb/C 小鼠超免方法
• 3.3.3 关于杂交瘤细胞株的筛选方法
• 3.3.4 关于PB mAb的亲和力测定
• 3.3.5 关于PB mAb的特异性鉴定
• 3.3.6 关于PB pAb 和PB mAb 的比较
• 3.4 小结
• 第四章 苯巴比妥残留快速检测 ELISA 试剂盒的研制及性能测定
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 阻断 ELISA 试剂盒的研制及性能测定
• 4.2.2 竞争 ELISA 试剂盒的研制及性能测定
• 4.3 讨论
• 4.3.1 关于小分子半抗原检测的 ELISA 模式
• 4.3.2 关于 ELISA 方法的主要影响因素
• 4.3.3 关于 ELISA 试剂盒的质量性能
• 4.3.4 阻断ELISA 与竞争ELISA 试剂盒的比较
• 4.4 小结
• 第五章 苯巴比妥残留快速检测免疫金标试纸的研制及性能测定
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 方法
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 胶体金的质量鉴定
• 5.2.2 待标PB mAb与胶体金最佳标记浓度的确定
• 5.2.3 检测试纸的组装
• 5.2.4 试纸检测方法的建立
• 5.2.5 检测试纸的性能测定
• 5.3 讨论
• 5.3.1 关于胶体金的制备
• 5.3.2 关于金标抗体的制备
• 5.3.3 关于NC 膜的选择
• 5.3.4 关于金标试纸的检测原理
• 5.3.5 关于检测试纸的质量特性
• 5.4 小结
• 第六章 竞争ELISA 试剂盒和金标试纸检测方法与HPLC 和GC-MS 确证方法的比较
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 材料
• 6.1.2 方法
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 四种检测方法的线性方程、回归系数、线性范围及检测限的比较
• 6.2.2 四种检测方法的回收率比较
• 6.2.3 GC-MS、PB-Kit 与 PB-Strip 测定阳性猪尿液中 PB 含量的结果比较
• 6.3 讨论
• 6.3.1 关于HPLC 测定PB 含量
• 6.3.2 关于 GC-MS 测定PB 含量
• 6.3.3 PB 残留不同检测方法灵敏度的比较
• 6.3.4 PB 残留不同检测方法所需时间和费用的比较
• 6.4 小结
• 研究结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介