油茶蒲多糖的制备、组分分析及抗肿瘤活性初步研究

论文摘要

中国是世界上最大的茶油生产基地。油茶主要分布在我国的西南及湘、赣南部的山地丘陵,它是我国特有的油料树种,另外,油茶在东南亚、日本等国也有极少量分布。油茶果是油茶树的果子,它由油茶蒲和油茶籽构成,质量比分别为60%和40%左右。经油茶籽提炼出来的山茶油,由于油酸和亚油酸含量合计在80%以上,具有很强的保健功能。油茶蒲可用来提栲胶、糠醛以及木糖醇等,还可用用制取活性炭和碳酸钾等。我国虽然油茶资源丰富,但对油茶蒲的开发利用却非常薄弱。目前,国内外学者对植物活性多糖的研究报道很多,却未涉及有关油茶蒲多糖。本文重点对油茶蒲多糖的提取、纯化及其抗肿瘤活性进行研究,主要研究内容和结果如下。（1）多糖的提取工艺优化研究以油茶蒲为原料、多糖得率为响应值,在单因素试验的基础上,通过正交试验优化工艺参数。研究了提取时间、提取温度、料液比和醇沉乙醇浓度四个因素对多糖得率的影响。实验结果表明,提取温度的影响达显著水平,提取时间、料液比和乙醇浓度则无显著影响。经优化后的油茶蒲多糖提取工艺参数为:温度90℃、时间1.0 h、料液比1:15、醇沉乙醇终浓度80%。在此条件下油茶蒲粗多糖得率为5.93%。（2）多糖的分离、纯化研究采用Sevag法经7次去蛋白操作后,CPPS中多糖含量损失率达到49.8%,但蛋白质的去除率仅为16.8%,去蛋白效果不明显。采用静态吸附实验模型,以多糖损失率、蛋白去除率及多酚去除率为考察指标,确定了DA-201为最佳的除杂大孔树脂类型。静态吸附实验结果表明:DA-201对CPPS溶液中蛋白质的去除率达到55.0%,对多酚的去除率高达76.2%。DA-201大孔树脂能有效去除CPPS中的蛋白质及多酚,且去蛋白效果优于Sevag法。CPPS经大孔树脂除杂后,得到两个主要多糖组分:CPPS1和CPPS2。其中,CPPS1得率为48.2%,与CPPS相比,多糖含量提高了29.4%,蛋白质含量下降了36.6%,总酚含量下降了52.3%。进一步采用DEAE-52纤维素柱层析纯化CPPS1和CPPS2,分别得到主要多糖组分CPPS1-1、CPPS1-2和CPPS2-1、CPPS2-2。（3）多糖的组分分析研究采用高效液相色谱法测定油茶蒲多糖的分子量分布,气相色谱法分析糖基组成。结果表明,油茶蒲多糖分子量分布范围为在2.9×103～2.8×105之间,经纯化后,CPPS中小分子量和大分子量多糖片段得到了一定分离。糖基分析结果显示,CPPS至少由鼠李糖（Rha）、岩藻糖（Fuc）、阿拉伯糖（Ara）、甘露糖（Man）、葡萄糖（Glu）以及半乳糖（Gal）等6种单糖组成,其质量分数依次为:6.65%、19.07%、2.67%、7.05%、48.76%以及15.78%。CPPS1-1的单糖组成和CPPS的单糖组成种类相同,但组成比例不同,CPPS1-1的单糖组成质量分数依次为:4.66%、8.84%、4.37%、8.86%、57.19%、16.06%。葡糖糖是油茶蒲多糖的主要结构单元。（4）多糖的抗氧化活性研究应用DPPH法、TEAC法、FRAP法和Fenton反应分别评价油茶蒲不同提取物的抗氧化活性。结果显示,CPPS物表现出一定的抗氧化活性,并具有浓度依赖关系。不同提取物的抗氧化能力强弱依次为:抗坏血酸＞水提物＞醇沉上清＞CPPS。（5）多糖的抗肿瘤活性初步研究依次采用体外四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）和小鼠体内S180肉瘤模型,考察CPPS的抑瘤活性。结果表明,其对宫颈癌细胞Hela、肺癌细胞H460、肝癌细胞HepG2的增殖均有较明显的抑制作用,且呈良好的浓度依赖关系。当试样浓度在500μg/mL时,对HepG2的生长抑制率达到74.54%,对H460的生长抑制率达到51.38%,对Hela的生长抑制率达到63.42%。同时,CPPS对小鼠S180肉瘤的生长也具有显著的抑制作用,当灌胃剂量为450 mg/kg时,对S180小鼠的肿瘤生长抑制率达到38.38%。研究结果表明,油茶浦多糖是一种极具研究价值和开发潜力的抗肿瘤活性多糖。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 绪论
• 第一章 多糖的研究进展
• 1.1 多糖概念
• 1.2 多糖分类
• 1.3 多糖的生物活性
• 1.3.1 抗氧化、抗衰老作用
• 1.3.2 降血糖
• 1.3.3 降血脂
• 1.3.4 对双歧杆菌的增殖作用
• 1.3.5 抗肿瘤作用
• 1.3.6 多糖的其它活性功能
• 1.4 多糖的抗肿瘤作用机制
• 1.4.1 癌症的预防作用
• 1.4.2 增强机体的免疫力
• 1.4.3 直接抑制癌细胞的生长
• 1.5 多糖的制备
• 1.5.1 多糖的提取
• 1.5.2 多糖的分离
• 1.5.3 多糖的纯化
• 1.6 结构分析
• 1.7 多糖的国内外研究现状
• 1.8 总结
• 第二章 油茶蒲多糖的提取工艺研究
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 试验材料
• 2.2.2 试剂与仪器
• 2.2.3 试验方法
• 2.2.3.1 油茶蒲多糖的提取
• 2.2.3.2 油茶蒲多糖得率的计算
• 2.2.3.3 单因素试验
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 单因素试验结果
• 2.3.1.1 温度的影响
• 2.3.1.2 提取时间的影响
• 2.3.1.3 料液比的影响
• 2.3.1.4 乙醇浓度的影响
• 2.3.2 油茶蒲多糖提取工艺优化
• 2.3.3 正交实验方差分析结果
• 2.3.4 验证实验
• 2.4 结论
• 第三章 油茶蒲多糖的分离纯化
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 试验材料
• 3.2.2 试剂与仪器
• 3.2.3 试验方法
• 3.2.3.1 CPPS中主要成分的测定
• 3.2.3.2 Sevag法去蛋白
• 3.2.3.3 树脂前处理
• 3.2.3.4 树脂类型筛选
• 3.2.3.5 树脂柱层析
• 3.2.3.6 纤维素柱层析分级纯化多糖
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 CPPS中主要成分的测定结果
• 3.3.2 Sevag法去蛋白结果
• 3.3.3 树脂类型筛选结果
• 3.3.4 树脂柱层析结果
• 3.3.5 纤维素柱层析分级纯化结果
• 3.4 总结
• 第四章 油茶蒲多糖的组分分析
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 试验材料
• 4.2.2 试剂及仪器
• 4.2.3 试验方法
• 4.2.3.1 液相色谱测定多糖分子量分布
• 4.2.3.2 气相色谱测定单糖组成
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 液相色谱测定多糖分子量分布结果
• 4.3.2 单糖组成分析
• 4.4 结论
• 第五章 油茶蒲多糖的体外抗氧化作用
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 试验材料
• 5.2.2 试剂与仪器
• 5.2.3 试验方法
• 5.2.3.1 油茶蒲提取物的制备
• 5.2.3.2 DPPH自由基清除率的测定
• 5.2.3.3 ABTS自由基清除率的测定
• 5.2.3.4 OH自由基清除率的测定
• 5.2.3.5 总抗氧化能力的测定
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 油茶蒲提取物清除DPPH自由基的作用
• 5.3.2 TEC法测定油茶蒲提取物的抗氧化能力
• 5.3.3 油茶蒲提取物对·OH的清除作用
• 5.3.4 FRAP法测定油茶蒲提取物的总抗氧化能力
• 5.4 结论
• 第六章 油茶蒲多糖的抗肿瘤作用初步研究
• 6.1 前言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 试验材料
• 6.2.2 试剂与仪器
• 6.2.3 试验方法
• 6.2.3.1 体外抑制癌细胞增殖实验
• 6.2.3.2 体内抑制肿瘤生长
• 6.2.3.3 统计方法
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 体外抑制癌细胞增殖作用
• 6.3.2 体内抑制肿瘤生长
• 6.4 结论
• 第七章 结论及展望
• 致谢
• 参考文献