黄花蒿杀螨物质活性追踪及杀螨作用机理研究

论文摘要

植物在生长发育过程中,其光合作用和呼吸作用都是极为复杂的生理生化反应,会产生大量的代谢产物。这些产物具有的某种生理活性或用途,一直在被人们加以利用。植物成分及其代谢产物是天然药物的重要组成部分。人类在长期与疾病作斗争的过程中,以身试药,日积月累,对天然药物主要是植物药的应用积累了丰富的经验。中草药在人们控制疾病的过程中发挥了十分重要的作用,而且这些中草药大多数对于控制害虫也有一定的效果。黄花蒿（Artemisia annua L.）是一年生草本植物,为菊科蒿属植物,是中药青蒿的主要药源植物。株高约40-150cm,全生育期210d左右。黄花蒿在我国各地都有分布,生态适应性广,常生于山坡、林地、荒地。药农常于秋季花盛开时割取地上部分,除去老茎,晾干即可药用。黄花蒿药用价值很高,其主要活性成分是青蒿素,主治疟疾、结核病潮热,还能治中暑、皮肤瘙痒、荨麻疹、脂溢性皮炎等病症。青蒿素的衍生物可生产很多系列药品。由于重庆独特的自然地理因素适合黄花蒿的生长,重庆是全球黄花蒿种植的最大基地,有“黄花蒿故乡”的美誉,开发黄花蒿的优势得天独厚。螨类,特别是植食性害螨,是严重为害我国农业生产的一类重要生物。它具有个体小、繁殖快、种群密度高、为害重等特点,可为害150余种作物。据不完全统计,我国每年用于柑橘、苹果、梨、桃、棉花、蔬菜、小麦、茶8类主要作物的杀螨剂防治费用就达90多亿元,而且随着螨类对化学药剂抗药性的逐年增加,防治费用也逐年加大。面对化学农药所产生的种种问题和杀虫杀螨剂常规研发途径的日益艰难,从生物活性天然产物中开发新的药剂已经成为国内外农药研究开发的热点问题之一。本研究得到了国家自然科学基金（30671392）和重庆市科技攻关项目（2001-6599）的资助。本文主要研究了生长期在4月、5月、6月、7月和9月的黄花蒿根、茎、叶等不同部位的多种溶剂提取物的提取率;各种提取物对朱砂叶螨,柑橘全爪螨和酢浆草岩螨的生物活性;7月份黄花蒿提取物对豇豆种子胚根和胚轴的生长抑制作用;追踪分离到黄花蒿杀螨活性物质东莨菪内酯;研究了东莨菪内酯对朱砂叶螨SOD,CAT,POD,GST,CarE,AChE,MAO,Ca2+-ATP等酶系比活力的影响。通过近3年的研究,获得了如下结果:1黄花蒿有机物质的提取率利用一系列溶剂对4月份采集的黄花蒿植株的根、茎、叶分别进行常规室温浸提、恒温浸提、室温搅拌提取和微波辅助萃取。4种提取方法对提取率的影响差异不大,从经济角度综合比较,采用室温搅拌提取较为适宜。对4、5、6、7、9月份采集的黄花蒿根、茎、叶分别用不同溶剂进行平行提取和顺序提取,从提取率来看,平行提取的提取率普遍高于顺序提取;无论是平行或是顺序提取,水的提取率都是最高的（根茎叶提取率均高于其他溶剂的提取率）,其次是丙酮,再次是乙醇。从不同的植株部位看,叶的提取率相对较高,其次是根,而茎最低。2植物源杀螨剂的生物活性测定方法的选择与评价生物测定方法对农药的研究与开发具有重要意义。基于此本研究首先从剂量大小、测定效果、测定效率和成本等方面对玻片毛细管法、玻片浸渍法、叶片浸渍法等三种方法进行了比较。结果表明玻片毛细管法测定的结果与FAO推荐使用的玻片浸渍法无明显差异,且其用药量大幅度下降,效率更高,适合于植物源杀螨剂的生物测定。3黄花蒿提取物的杀螨活性3.1对朱砂叶螨的生物活性为了明确黄花蒿杀螨活性物质的最佳提取工艺,选择合适的溶剂和最佳的植株部位;明确黄花蒿杀螨活性物质的动态分布状态,从而为综合开发利用黄花蒿提供科学依据。将分别采集于4、5、6、7和9月5个月份的黄花蒿植株,分成根、茎、叶3个部分,采用石油醚（30～60℃）、石油醚（60～90℃）、乙醇、丙酮和水溶剂的平行和顺序提取方法,共计获得135种提取物,用玻片毛细管法测定其对朱砂叶螨的生物活性。在杀螨活性方面,黄花蒿的杀螨活性随植株的生长呈增加的趋势,总体表现为7月份＞6月份＞5月份＞4月份,但9月份的杀螨活性与7月份相比有所下降。5个月份的黄花蒿叶丙酮平行提取物的活性都比相同月份的其他提取物强,药剂浓度为5mg·mL-1时,处理朱砂叶螨48h的校正死亡率介于74%～100%之间。黄花蒿不同月份叶的丙酮平行提取物对朱砂叶螨的LC50随植物材料的采集时间不同呈规律性变化,4月份、5月份、6月份、7月份和9月份黄花蒿叶的丙酮平行提取物对朱砂叶螨处理48h,LC50分别为1.3817,0.9443,0.8376,0.4341和0.5986mg·mL-1。3.2对柑橘全爪螨的生物活性对采自于6月份的黄花蒿根茎叶不同溶剂提取物对柑橘全爪螨的生物活性测定结果表明:在同等条件下,叶提取物中除石油醚Ⅱ顺序提取物和水顺序提取物外,其他提取物的生物活性均比根和茎的提取物活性有明显的提高。其中叶丙酮平行提取物对柑橘全爪螨在5mg·mL-1处理48h后生物活性最高,校正死亡率为88.84%,而石油醚Ⅱ平行提取物在相同条件下对柑橘全爪螨的校正死亡率亦达84.27%。7月份黄花蒿叶的不同溶剂提取物对柑橘全爪螨的生物活性亦明显高于根和茎的活性。其中叶的丙酮平行提取物活性最高,5mg·mL-1处理48h后,对柑橘全爪螨的校正死亡率达100%。黄花蒿7月份叶丙酮平行提取物对柑橘全爪螨的生物活性明显高于6月份,对柑橘全爪螨处理48h后,7月份的LC50(0.4222mg·mL-1)仅为6月份(0.9489mg·mL-1)的44%。3.3对酢浆草岩螨的生物活性黄花蒿6月份根、茎、叶不同溶剂的提取物对酢浆草岩螨的活性普遍不高。采集于7月份的黄花蒿植株的不同部位,采用极性不同的几种溶剂,用平行和顺序提取的方法获得的提取物对酢浆草岩螨表现出优越于6月份的生物活性。其中7月份叶的丙酮平行提取物生物活性最高,处理48h,对酢浆草岩螨的校正死亡率为95.00%。7月份黄花蒿叶丙酮平行提取物对酢浆草岩螨处理48h,其LC50是0.4715mg·mL-1,而6月份的为0.9083mg·mL-1。4 7月份黄花蒿提取物对豇豆种子的植物毒性前面已经证实了黄花蒿7月份植株总体上对朱砂叶螨、柑橘全爪螨和酢浆草岩螨都具有较强的杀螨活性,为了考察提取物的植物毒性作用,研究了7月份黄花蒿植株根、茎、叶不同溶剂的平行和顺序提取物对叶螨类主要寄主植物之—豇豆的种子发芽率,种子胚根、胚轴的生长抑制情况。结果表明:7月份黄花蒿根、茎、叶不同溶剂的平行和顺序提取物对豇豆种子发芽的影响存在一定的差异。其中茎的乙醇顺序提取物对豇豆种子发芽率的影响最大,表现出明显抑制作用,发芽率仅为23.81%,此外叶的丙酮顺序提取物对豇豆种子发芽率的影响也较大,发芽率为40.48%,而叶的丙酮平行提取物对豇豆种子发芽率影响甚微。7月份黄花蒿根、茎、叶的不同溶剂提取物对豇豆种子胚根、胚轴的生长抑制作用较弱;有些还表现出刺激生长作用。5黄花蒿杀螨活性物质追踪分离采用生物活性追踪法,测定了黄花蒿7月份叶的丙酮平行提取物柱层析所得不同组分对朱砂叶螨的生物活性。在最终分离出的20种组分中,组分17的杀螨活性最高,组分18和8次之。组分17,18和8的LC50（48h）分别为0.1675,0.4368和0.3753mg·mL-1,其中组分17的活性相对于7月叶丙酮提取物而言提高大约2.6倍。也测定了黄花蒿7月份叶的丙酮平行提取物柱层析所得的不同组分对柑橘全爪螨的杀螨活性,其中组分、17的杀螨活性最高,处理48h后,校正死亡率达到96.65%,与其他组分的杀螨活性存在显著差异。同样测定了柱层析最终分离出的20种组分对酢浆草岩螨的生物活性,其中组分19的杀螨活性最高,2.5mg·mL-1浓度下,处理48h后的校正死亡率达到69.28%。而综合有效含量和生物活性两个因素考虑,组分17最具研究价值。因此对组分17进行了进一步的分离纯化,选择朱砂叶螨做为进一步活性追踪的供试螨类。组分17中含有三个主要的成分,其中17-3占的比例最高为77.64%,17-1次之,为16.21%,17-2所占比例最小,仅为5.31%。三种成分进行TLC分析,经碘显色,可见的斑点数均为一个,且无拖尾。三种成分对朱砂叶螨的生物活性测定结果表明,17-3具有较强的杀螨活性,处理48h,对朱砂叶螨的LC50为0.1014mg·mL-1,与整个第17组分对朱砂叶螨的LC50为0.1675mg·mL-1相比,毒力有所提高。对17-3进行重结晶实验,在一定的温度下分别用无水甲醇、丙酮、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁烷溶解,重结晶,放冰箱冷却静置得到晶体,从中选出最佳的温度和溶剂。结果表明,根据结晶晶形以及溶剂用量判断,以乙酸乙酯为溶剂在55℃下结晶的效果最好。随后用HPLC-MS、1H-NMR、IR等手段,确定纯化后的17-3为东莨菪内酯scopoletin,分子量:192.17,分子式:C10H8O4。生物测定结果表明,对17-3进行重结晶纯化所得的东莨菪内酯对朱砂叶螨的生物活性较17-3有所增强。6东莨菪内酯对朱砂叶螨的致死机理朱砂叶螨受东莨菪内酯处理后,其超氧化物歧化酶（SOD）活性随着处理时间的延长表现出先升高再下降的趋势,但整体上表现为受药剂处理的酶活性低于对照。所有处理测得的过氧化氢酶（CAT）活性均有所提高,表明朱砂叶螨在受到东莨菪内酯处理后,CAT在一定程度上被激活。POD活性均较对照有明显下降,且随药剂浓度的变化而略有差异。总体表现为朱砂叶螨受到东莨菪内酯处理后,其体内的POD活性受到了明显的抑制。朱砂叶螨在受到东莨菪内酯处理后谷胱甘肽-S-转移酶（GST）活力有所提高。随着处理时间的延长,处理组的酶活力都高于对照组,但整体上表现出下降的趋势,尤其是在处理48h后,酶活力均降至最低水平。东莨菪内酯激活了朱砂叶螨羧酸酯酶（CarE）的活性,且随着药剂浓度的增加酶活性被激活的程度也随之增大。而乙酰胆碱酯酶（AChE）活性表现出先上升再下降的趋势。Ca2+-ATP酶的活力有不同程度的下降,表明东莨菪内酯对Ca2+-ATP酶有一定的抑制作用。就单胺氧化酶（MAO）的活性而言,处理组与对照组的MAO的活力变化趋势接近,但均低于对照组,因此,MAO受到了一定程度的抑制。

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中文摘要

Summary

第一章文献综述

1 农业害螨的系统控制

1.1 以螨类寄主植物为出发点的控制策略

1.1.1 作物品种的抗螨性

1.1.2 利用生物多样性控制害螨

1.1.3 植物的次生代谢物质对害螨的控制

1.2 从螨的生物学特性为出发点的控制策略

1.2.1 利用影响螨类生长的环境因素进行控制

1.2.2 针对螨类不同虫态制定控制对策

1.3 利用天敌等其他生物学因子进行控制的策略

1.3.1 以螨治螨

1.3.2 以虫治螨

1.3.3 以菌治螨

1.4 农业害螨的化学控制

1.4.1 目前常用的杀螨剂

1.4.2 科学使用杀螨剂

2 植物源杀螨剂的研究概况

2.1 天然杀螨活性物质的研究进展

2.1.1 生物碱类

2.1.2 柠檬素类

2.1.3 植物精油

2.1.4 黄酮类化合物

2.1.5 其他

2.2 植物源杀螨剂存在的问题

2.3 研究植物源杀螨剂的意义

2.4 植物源杀螨剂的应用前景

3 黄花蒿农用活性研究进展及杀螨研究的可行性分析

3.1 黄花蒿杀虫活性

3.2 黄花蒿抗微生物活性

3.3 黄花蒿植物化感作用

3.4 其他活性

4 选题依据与研究的意义

第二章黄花蒿提取物的获取方法

1 材料与方法

1.1 植物材料

1.2 使用的主要溶剂

1.3 主要试验仪器

1.4 提取方法的选择

1.4.1 室温浸提法

1.4.2 恒温浸提法

1.4.3 室温搅拌提取法

1.4.4 微波辅助萃取法

1.4.5 提取率的计算方法

1.5 五个月份黄花蒿提取物的获得

2 结果与分析

2.1 4月份黄花蒿不同部位不同提取方法的提取率

2.2 五个月份黄花蒿提取物的提取率

3 讨论

3.1 溶剂的选择

3.2 提取方法

3.3 不同植株部位对黄花蒿提取率的影响

3.4 不同收获时期对黄花蒿提取率的影响

3.5 提取率与提取活性成分物质之间的关系

第三章植物源杀螨剂活性测定方法的选择与评价

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试螨类

1.1.2 试验设备

1.1.3 供试药剂

1.2 试验方法

1.2.1 玻片毛细管法

1.2.2 玻片浸渍法

1.2.3 叶片浸渍法

2 结果与分析

2.1 不同处理方法对药剂剂量的要求

2.2 不同处理方法对生物测定结果的影响

3 讨论

3.1 不同试验方法对药剂剂量的要求

3.2 不同试验方法对生物测定结果的影响

第四章黄花蒿提取物的杀螨活性及对害螨寄主作物的植物毒性评价

第一节黄花蒿提取物对朱砂叶螨的生物活性

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 实验方法

2 结果与分析

2.1 黄花蒿4,5,6,7和9月份提取物对朱砂叶螨的触杀活性

2.2 不同月份黄花蒿叶丙酮平行和顺序提取物对朱砂叶螨的杀螨活性动态

2.3 黄花蒿几种提取物对朱砂叶螨的毒力

2.4 黄花蒿7月叶丙酮提取物柱层析所得不同组分对朱砂叶螨的杀螨活性比较

3 讨论

第二节黄花蒿提取物对柑橘全爪螨的生物活性

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 实验方法

2 结果与分析

2.1 黄花蒿6和7月份提取物对柑橘全爪螨的触杀活性

2.2 黄花蒿几种提取物对柑橘全爪螨的毒力回归分析

2.3 黄花蒿7月叶丙酮提取物柱层析所得不同组分对柑橘全爪螨的杀螨活性比较

3 讨论

第三节黄花蒿提取物对酢浆草岩螨的生物活性

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 实验方法

2 结果与讨论

2.1 黄花蒿6和7月份提取物对酢浆草岩螨的触杀活性

2.2 黄花蒿几种提取物对酢浆草岩螨的毒力

2.3 黄花蒿7月叶丙酮提取物柱层析所得不同组分对酢浆草岩螨的杀螨活性比较

3 结论与讨论

第四节黄花蒿提取物对害螨寄主作物的植物毒性评价

1 材料与方法

1.1 植物材料

1.2 提取物的获得

1.3 发芽率与胚根胚轴生长抑制率的测定

2 结果与分析

2.1 对豇豆种子发芽率的影响

2.2 对豇豆种子胚根生长量的影响

2.3 对豇豆种子胚根和胚轴生长抑制率的影响

3 讨论

第五章黄花蒿杀螨物质的活性追踪,分离,鉴定

第一节 7月份黄花蒿叶丙酮平行提取物的活性追踪

1 材料与方法

1.1 供分离材料

1.2 活性追踪指示螨类

1.3 主要仪器和试剂

1.4 薄层层析定性检测

1.5 硅胶柱色谱分离

1.6 高效液相色谱定量鉴定

2 结果与分析

2.1 薄层层析定性分离

2.2 硅胶柱色谱分离及相应组分生物活性评价

2.3 高效液相色谱定量分析

3 讨论

第二节 7月份黄花蒿叶丙酮提取物17组分的进一步分离和纯化

1 材料与方法

1.1 供分离材料

1.2 活性追踪指示螨类

1.3 主要仪器和试剂

1.4 薄层层析定性检测

1.5 硅胶柱色谱分离

1.6 高效液相色谱-质谱定性、定量鉴定

2 结果与分析

2.1 硅胶柱色谱分离效果

2.2 高效液相色谱的分离效果

2.3 17-1、17-2、17-3的活性评价

3 讨论

第三节 17-3的纯化、鉴定和活性评价

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.2 供试螨类

1.3 主要仪器和试剂

1.4 结晶与重结晶操作

1.5 HPLC-MS定性、定量鉴定

1.6 生物活性评价

2 结果与分析

2.1 17-3纯化

2.2 17-3结晶结构鉴定

2.3 东莨菪内酯的生物活性测定

3 讨论

3.1 结晶与重结晶的相关问题

3.2 东莨菪内酯的纯化与生物活性测定

第六章东莨菪内酯对朱砂叶螨的作用机理探讨

第一节东莨菪内酯对朱砂叶螨3种保护酶的影响

1 材料与方法

1.1 供试朱砂叶螨

1.2 供试药剂及试验仪器

1.3 酶源制备

1.4 酶活性测定

2 结果与分析

2.1 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定

2.2 过氧化氢酶（CAT）活性测定

2.3 过氧化物酶（POD）活性测定

3 讨论

第二节东莨菪内酯对朱砂叶螨谷胱甘肽-S-转移酶的影响

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 主要试剂

1.3 实验方法

2 结果与分析

3 讨论

第三节东莨菪内酯对朱砂叶螨羧酸酯酶的影响

1 材料与方法

1.1 供试朱砂叶螨

1.2 供试试剂和主要仪器

1.3 试剂配制

1.4 药液的配制

1.5 试虫处理及酶液制备

1.6 活力测定方法与步骤

2 结果与分析

2.1 蛋白质标准曲线的制作及朱砂叶螨酶源蛋白含量

2.2 东莨菪内酯对朱砂叶螨羧酸酯酶比活力的影响

3 讨论

第四节东莨菪内酯对朱砂叶螨乙酰胆碱酯酶的影响

1 材料与方法

1.1 供试朱砂叶螨

1.2 主要试剂及仪器

1.3 测定方法

2 结果与分析

2.1 朱砂叶螨酶源蛋白含量

2.2 东莨菪内酯对朱砂叶螨羧酸酯酶比活力的影响

3 讨论

2+-ATP酶的影响'>第五节东莨菪内酯对朱砂叶螨Ca²⁺-ATP酶的影响

1 材料与方法

1.1 供试朱砂叶螨

1.2 主要仪器和试剂

1.3 试螨处理和酶液制备

2+-ATP酶的影响'>1.4 对朱砂叶螨Ca²⁺-ATP酶的影响

2 结果与分析

3 讨论

第六节东莨菪内酯对朱砂叶螨单胺氧化酶的影响

1 材料与方法

1.1 供试朱砂叶螨

1.2 仪器设备及主要试剂

1.3 对朱砂叶螨单胺氧化酶的影响

2 结果与分析

3 讨论

第七节东莨菪内酯对朱砂叶螨致死作用机理探讨

第七章主要结论与展望

1 研究的主要结论

1.1 黄花蒿有机化合物的提取方法与提取率

1.2 适合于植物源杀螨剂的生物测定方法

1.3 黄花蒿提取物的杀螨活性

1.4 7月份黄花蒿提取物对豇豆种子生长的影响

1.5 黄花蒿杀螨活性物质追踪分离

1.6 东莨菪内酯对朱砂叶螨的致死机理

2 本项研究的创新点

3 有待于进一步研究的问题

3.1 对东莨菪内酯的杀螨作用机理的深入研究

3.2 对17-1的进一步分离纯化和结构鉴定

参考文献（References）

个人简历及攻博期间取得的成绩

致谢

黄花蒿杀螨物质活性追踪及杀螨作用机理研究

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