论文摘要
核黄素可通过生物合成、代谢与功能途径的多个环节,尤其是黄素介导的氧化还原作用,影响植物防卫和生长发育。核黄素是一种新发现的植物抗病激发子,外源施用核黄素能够诱导植物对多种病害的抗性,启动不同于其它已知的抗病信号通路,但其机制仍不清楚。核黄素参与植物抗氧化及过氧化过程,从而影响氧化性损伤及后续过敏反应过程中活性氧的产生。活性氧是过敏性细胞坏死（hypersensitive cell death,HCD）的重要信号,能调节生长、抗病、抗虫、抗逆。另外,植物受不同诱导因子刺激后,迅速调动防卫反应机制,一旦有病原物侵染,植物可以快速、有效地进行防卫发应,这种现象称为“防御准备过程（priming）”。本论文研究的目的是实验阐释核黄素是否通过priming机制来诱导植物防卫反应。1外源核黄素诱导的引发抗病防卫反应依赖过氧化氢和NPR1基因近几年的研究表明,priming可能是植物诱导抗性的重要机制。拟南芥用核黄素处理后,致病相关基因PR-1和PR-2表达量明显增加,但苯丙氨酸解氨酶基因PAL1表达水平无明显变化。当拟南芥先用核黄素处理,再接种丁香假单胞番茄致病变种（Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000）时,细胞防卫反应及防卫反应基因表达均比未处理时增强,同时诱发过氧化氢（hydrogen peroxide,H2O2）的积累、胼胝质沉积和过敏性细胞死亡。用过氧化氢清除剂（catalase,CAT）处理拟南芥完全消弱了植物细胞和分子水平的防卫反应及其对病原菌的抗性。核黄素处理并接种病原菌时诱发的细胞防卫反应在水杨酸（salicylic acid,SA）、乙烯（ethylene,ET）、茉莉酸（iasmonic acid,JA）和脱落酸（abscisic acid,ABA）信号通路的突变体上可以产生,但在npr1突变体中消失。研究结果表明,外施核黄素使植物进入防御准备状态,接种病原菌后,植物体内积累高浓度的过氧化氢,并激发细胞防卫反应和相关基因的快速高强度表达以及对病原菌的抗性,这一过程依赖于过氧化氢和NPR1基因,但不依赖于SA、ET、JA和ABA信号通路。2核黄素引发抗病防卫信号传导机制研究为了证明外施核黄素是否导致体内氧化还原态的改变并且这一改变在引发抗病防卫反应中的作用,我们检测了核黄素处理拟南芥5 d内的氧化还原动态变化。结果发现,在0 h至5 d内,外源核黄素处理激发植物体内的ROS积累且在2 h达到高峰值,5 d后恢复到原来水平;我们通过3,3-二氨基联苯胺（diaminobenzine,DAB）染色、H2O2含量测定、百草枯（paraquat,PQ）敏感性测定,发现拟南芥经核黄素处理后体内氧化还原态改变,氧化态升高。植物喷施核黄素后再注射CAT,植物体内氧化态降低;而且5 d后接种P.syringae pv.tomato DC3000,植物体内没有出现细胞防卫反应,其抗病性与喷施核黄素植株相比显著降低,这表明,核黄素处理拟南芥后导致的还原状态的改变对核黄素诱导抗病性是必需的。3 FAO在拟南芥抗病防卫反应中的作用含黄素的长链脂肪醇氧化酶（FAO）最初从假丝酵母中纯化得到。这种酶结合在膜上,包含黄素,且与过氧化氢产生相关。过氧化氢是植物体内活性氧的主要形式之一。研究表明,植物抗病过程中产生的活性氧对植物抵御病原菌的侵染具有重要的意义。植物能识别入侵的病原菌,并启动体内一系列的防御性反应,将入侵物限制在特定位点,从而使植物免受更大的侵害。为了解析FAO在拟南芥抗病防卫反应中的作用,我们使用野生型拟南芥及fao3突变体进行试验。通过叶片过氧化氢含量测定,发现fao3突变体植株中的活性氧水平比野生型植株低;喷施ROS供体百草枯后,突变体植物对百草枯不够敏感,这表明突变体植物体内的氧化还原平衡被打破（具有较低的氧化态）。为了解析突变体植物抗病性与氧化还原平衡改变的关系,我们通过接种P.syringae pv.tomato DC3000,对抗病性表型和菌落生长曲线进行观测,并检测了两种植物体内的ROS水平。结果表明,FAO与过氧化氢产生相关,突变体植物体内的氧化还原状态改变影响了植物抗病防卫反应。利用膜蛋白提取方法,在拟南芥野生型及突变体中粗提出膜蛋白,并第一次在植物体内测定了FAO的酶活性。