奶山羊乳腺脂肪酸合酶基因表达的RNA干扰研究

论文摘要

哺乳动物的脂肪酸合酶（Fatty acid synthase, FAS）利用乙酰-CoA、丙二酸单酰-CoA和NADPH等催化饱和脂肪酸的合成。山羊乳腺短、中链脂肪酸合成受到FAS中的乙酰/丙二酸单酰基转移酶（Acetyl-CoA and malonyl-CoA transacylases, AT/MT）功能域的转酰基作用调控。通过调控FAS基因表达而改变山羊乳脂肪酸组成,是探讨动物脂肪酸合成机理的重要方法之一。本研究通过添加不同浓度的17β-雌二醇（脂肪酸合酶基因的化学抑制剂）和RNA干扰技术抑制乳腺细胞脂肪酸合酶基因的表达,对其功能进行初步研究,为奶山羊乳腺脂肪酸合成代谢的分子机理研究提供依据。主要包括以下内容:（1）以健康的纯种西农萨能羊为实验动物,构建奶山羊乳腺上皮细胞体外培养体系,并对其生长特性、形态学特征、细胞遗传和β-酪蛋白表达等相关特性进行了分析和鉴定,为研究乳腺细胞的基因功能奠定了基础;（2）利用MTT法、LDH酶活性测定、实时定量PCR技术、气相色谱技术和透射电子显微镜研究了17β-雌二醇对山羊乳腺上皮细胞增殖分化的影响、乳腺上皮内脂肪酸合酶基因和脂肪酸组成含量的影响以及乳腺上皮细胞超微结构的影响;（3）采用化学合成siRNA、脂质体转染、MTT法、LDH酶活性测定、实时定量PCR技术、Western blotting和气相色谱技术和透射电子显微镜等研究了沉默脂肪酸合酶基因后山羊乳腺上皮细胞的增殖及分化情况、脂肪酸组成含量以及乳腺上皮细胞超微结构的影响。主要研究结果如下:1.用组织块培养法可获得良好的山羊乳腺细胞原代产物;培养的山羊乳腺成纤维细胞比上皮细胞对胰蛋白酶更敏感,据此可在传代过程中将二者分离纯化,获得纯细胞系;形态学观察表明,培养的细胞具有典型的上皮细胞形态学特征;染色体分析结果表明,培养的细胞具有正常的染色体数目;通过荧光免疫细胞染色方法鉴定了培养的细胞能够表达上皮细胞特异的角蛋白5和8;该细胞在用诱导培养液培养时,用实时定量PCR方法检测到了β-酪蛋白基因的转录。2.17β-雌二醇对山羊乳腺上皮细胞的增殖分化及其脂肪酸组成含量具有重要的调控作用,且其作用与浓度相关。25μmol/L、250μmol/L和500μmol/L的17β-雌二醇均可显著刺激山羊乳腺上皮细胞增殖,显著提高乳腺上皮细胞中脂肪酸合酶基因的表达丰度,从而改变山羊乳腺上皮细胞中脂肪酸的组成含量,还可以改变乳腺上皮细胞的超微结构;100μmol/L的17β-雌二醇可使乳腺上皮细胞培养液中LDH酶活力的极显著增强,从而引起乳腺上皮细胞发生严重的病理组织形态性损伤,显著降低乳腺上皮细胞中脂肪酸合酶基因的表达丰度,还能诱发乳腺上皮细胞凋亡。3.沉默山羊乳腺上皮细胞脂肪酸合酶基因,可抑制乳腺上皮细胞的增殖,增加乳腺上皮细胞的形态损伤,改变乳腺上皮细胞中的脂肪酸组成含量,短链脂肪酸的百分含量极显著下降,中链脂肪酸的百分含量显著升高,长链脂肪酸的百分含量略有变化,并诱发乳腺上皮细胞发生凋亡,产生凋亡小体,同时,线粒体也出现肿胀,破裂现象。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 乳腺脂肪酸合成机理的研究进展
• 1.1.1 乳腺的结构与功能
• 1.1.2 乳腺的能量代谢
• 1.1.3 反刍动物中乳腺组织中脂肪酸的合成
• 1.1.4 乳腺中脂肪酸合成的种间差异
• 1.2 脂肪酸合酶基因（FAS）的研究进展
• 1.2.1 脂肪酸合酶（FAS）的概念与生理功能
• 1.2.2 脂肪酸合酶基因的研究
• 1.2.3 脂肪酸合酶的肿瘤生物学意义
• 1.2.4 脂肪酸合酶基因的研究现状
• 1.3 RNAi 的回顾与展望
• 1.3.1 RNAi 的作用机制
• 1.3.2 RNAi 的特性和优点
• 1.3.3 siRNA 的产生策略
• 1.3.4 应用 RNAi 分析哺乳动物细胞基因功能
• 第二章 奶山羊乳腺上皮细胞体外分离与培养
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 样品采集
• 2.1.2 试剂与药品
• 2.1.3 仪器设备
• 2.1.4 鼠尾胶原的制备和使用方法
• 2.1.5 细胞原代培养
• 2.1.6 细胞传代及上皮细胞的纯化
• 2.1.7 细胞的冻存与解冻复苏培养
• 2.1.8 培养细胞生物学性状检测
• 2.1.9 中期分裂相染色体的制备与核型分析
• 2.1.10 用荧光免疫细胞染色法鉴定乳腺上皮细胞
• 2.1.11 实时定量PCR 检测β-酪蛋白mRNA 水平的表达
• 2.1.12 统计分析
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 鼠尾胶原对组织块培养的影响
• 2.2.2 不同基础培养液对细胞原代培养的影响
• 2.2.3 各种酶对奶山羊乳腺组织块的消化结果
• 2.2.4 奶山羊乳腺上皮细胞与成纤维细胞的分离纯化
• 2.2.5 不同冻存液对奶山羊乳腺上皮细胞贴壁率的影响
• 2.2.6 细胞生物学性状
• 2.2.7 核型分析
• 2.2.8 荧光免疫细胞染色分析细胞角蛋白5 和8 的表达
• 2.2.9 实时定量PCR 检测β-酪蛋白mRNA 水平的表达
• 2.3 讨论
• 2.3.1 奶山羊乳腺上皮细胞培养体系的建立
• 2.3.2 奶山羊乳腺上皮细胞的形态学特征
• 2.3.3 奶山羊乳腺上皮细胞的鉴定
• 2.3.4 奶山羊乳腺上皮细胞的β酪蛋白表达
• 第三章 17β-雌二醇在奶山羊乳腺上皮细胞增殖分化中的调控作用
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 样品采集
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 仪器设备
• 3.1.4 奶山羊乳腺上皮细胞的培养
• 3.1.5 MTT 法检测乳腺上皮细胞增殖
• 3.1.6 乳腺上皮细胞培养液中LDH 酶活性的测定
• 3.1.7 雌激素对奶山羊乳腺上皮细胞脂肪酸合酶基因的影响
• 3.1.8 雌激素对奶山羊乳腺上皮细胞中脂肪酸组成含量的影响
• 3.1.9 雌激素对奶山羊乳腺上皮细胞超微结构的影响
• 3.1.10 统计分析
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 MTT 法检测雌激素对奶山羊乳腺上皮细胞增殖的影响
• 3.2.2 雌激素对奶山羊乳腺上皮细胞LDH 酶的影响
• 3.2.3 实时定量PCR 检测脂肪酸合酶基因mRNA 水平的表达
• 3.2.4 雌激素对奶山羊乳腺上皮细胞中脂肪酸组成含量的影响
• 3.2.5 雌激素对奶山羊乳腺上皮细胞超微结构的影响
• 3.3 讨论
• 3.3.1 雌激素对奶山羊乳腺上皮细胞增殖的影响
• 3.3.2 雌激素对奶山羊乳腺上皮细胞培养液LDH 酶活性的影响
• 3.3.3 雌激素对奶山羊乳腺上皮细胞中脂肪酸合酶的影响
• 3.3.4 雌激素对奶山羊乳腺上皮细胞中脂肪酸组成含量的影响
• 3.3.5 雌激素对奶山羊乳腺上皮细胞超微结构的影响
• 第四章 沉默脂肪酸合酶基因对乳腺上皮细胞的影响
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 样品采集
• 4.1.2 主要试剂
• 4.1.3 设备
• 4.1.4 主要溶液的配制
• 4.1.5 奶山羊乳腺上皮细胞获得
• 4.1.6 绿色荧光蛋白载体转染奶山羊乳腺上皮细胞
• 4.1.7 siRNAs 合成、转染及最佳浓度和有效序列的筛选
• 4.1.8 MTT 法检测乳腺细胞的增殖
• 4.1.9 乳腺上皮细胞培养液中LDH 酶活性的测定
• 4.1.10 实时定量PCR 检测脂肪酸合酶基因的表达
• 4.1.11 Western blotting 检测脂肪酸合酶的蛋白表达
• 4.1.12 沉默脂肪酸合酶基因对奶山羊乳腺上皮细胞脂肪酸组成含量的影响
• 4.1.13 沉默脂肪酸合酶基因对奶山羊乳腺上皮细胞超微结构的影响
• 4.1.14 统计分析
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 绿色荧光蛋白载体转染奶山羊乳腺上皮细胞
• 4.2.2 FAM-siRNA 转染奶山羊乳腺上皮细胞筛选最佳浓度
• 4.2.3 siRNAs 转染奶山羊乳腺上皮细胞
• 4.2.4 Western blotting 检测脂肪酸合酶的蛋白表达
• 4.2.5 FAS siRNA 对奶山羊乳腺上皮细胞增殖的影响
• 4.2.6 转染FAS-siRNA 对奶山羊乳腺上皮细胞LDH 的影响
• 4.2.7 转染FAS-siRNA 对奶山羊乳腺上皮细胞中脂肪酸组成含量的影响
• 4.2.8 转染FAS-siRNA 对奶山羊乳腺上皮细胞超微结构的影响
• 4.3 讨论
• 4.3.1 siRNA 在乳腺上皮细胞中的应用
• 4.3.2 沉默脂肪酸合酶基因对奶山羊乳腺上皮细胞的影响
• 4.3.3 沉默脂肪酸合酶基因对奶山羊乳腺上皮细胞超微结构的影响
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介