论文题目: 香蕉果实特异表达cDNA及果实特异表达启动子的分离鉴定
论文类型: 博士论文
论文专业: 作物遗传育种
作者: 徐碧玉
导师: 金志强
关键词: 香蕉,抑制缩减杂交,微阵列,果实特异表达,葡聚糖磷酸化酶基因,香蕉凝集素基因启动子,番茄,遗传转化
文献来源: 华南热带农业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 香蕉和大蕉是热带、亚热带发展中国家的最重要作物之一。是全球约四亿人的日常食物,香蕉已成为世界第四大粮食作物。香蕉贸易是产蕉国家及地区换取外汇的主要方式。特别是发展中国家,从中获取85%,目前香蕉已是许多发展中国家农业的重要组成部分,正迅速发展。中国的香蕉产量居世界第四位,是热带农业的支柱产业。香蕉为典型的呼吸跃变型水果,果实采后不耐储藏。对其采后生理学及分子生物学研究已成为研究热点,目的在于深入了解该类果实后熟机理,为延长果实保鲜期提供理论依据及为创造保鲜新方法奠定基础。 微阵列是目前功能基因组学研究的重要手段之一,该方法可高通量、快速筛选目的基因,同时可研究基因在发育过程中的表达情况。我们首次利用此方法对通过抑制差减法获得的287个香蕉采后两天果实的cDNA片段进行了不同器官的表达研究,通过计算机自动扫描及软件分析,共获得32个果实特异的cDNA片段。进行Blastn和Blastx比较分析,结果表明获得32个果实特异表达cDNA片段,包括信号转导(4个)、成熟相关蛋白(4个)、蛋白激酶(3个)及物质代谢(9个)等相关基因。根据芯片扫描光吸收值得大小,选取大、中、小的三个克隆(编号BR24、BR47、BR63)进行Northern blot分析,结果证明三个克隆均为果实特异表达,表达量也与芯片一致。选取编号BR63的克隆利用RACE方法获得5′端500bp,3′端1800bp。测序结果表明该cDNA全长2443bp,含有一个完整的阅读框架,长1959bp,编码652个氨基酸。氨基酸同源性比较(BlastX)与小麦、水稻的淀粉磷酸化酶基因(α-1,4-葡聚糖磷酸化酶)同源72%。结合香蕉采后成熟过程中乙烯释放量及呼吸强度测定变化特点,选取采后成熟不同时间段的果实提取RNA反转录cDNA,利用RT-PCR方法对各时间段mRNA表达进行检测,结果表明,在采收前(0h)未有表达,采收后随着成熟度提高表达量逐渐下降。说明该基因的表达是在呼吸跃变之前,而在跃变开始时,已很少或不表达。 栽培香蕉基本是三倍体,常规育种较为困难。近年来随着生物技术,特别是转基因技术的不断成熟及香蕉再生体系的不断完善,利用生物技术培育香蕉新品种已成共识。同时由于香蕉自身的特点,将其作为生物反应器生产口服疫苗及有用的化合物也成研究的热点。外源基因特异高效表达,启动子的作用十分重要,香蕉为单子叶植物,
论文目录:
1 前言
1.1 香蕉的特性及经济意义
1.2 香蕉果实采后生理学研究进展
1.3 香蕉果实分子生物学研究进展
1.3.1 分离香蕉采后果实乙烯生物合成相关的基因
1.3.2 采用差异筛选方法分离果实成熟相关基因
1.3.3 采用分离蛋白质方法克隆果实成熟相关基因
1.3.4 其它重要果实成熟相关基因的分离与表达研究
1.3.5 淀粉酶生理及分子生物学研究进展
1.4 基因芯片(gene chip)技术
1.4.1 基因芯片原理
1.4.2 基因芯片分类
1.4.3 芯片在植物功能基因组学研究中的应用
1.4.3.1 利用芯片技术研究植物基因的结构
1.4.3.2 利用芯片技术研究基因表达与发育生物学
1.4.3.3 利用芯片技术研究基因的表达水平，建立基因表达谱
1.4.3.4 利用基因芯片技术筛选抗性基因
1.4.3.5 利用基因芯片技术研究基因突变及多态性分析
1.4.3.6 利用芯片技术鉴定重要的目的基因
1.5 抑制差减杂交技术
1.5.1 SSH技术路线
1.5.2 SSH的特点
1.5.3 SSH在植物功能基因组学研究上的应用
1.6 植物启动子研究进展
1.6.1 高等植物启动子的结构
1.6.1.1 转录起始位点
1.6.1.2 TATA盒、CAAT盒与GC结构
1.6.1.3 增强子和沉默子
1.6.2 启动子的类型
1.6.2.1 组成型启动子
1.6.2.2 组织特异性启动子
1.6.2.3 诱导型启动子
1.6.3 香蕉启动子分离及应用概况
1.7 本论文研究的目的意义
2 微阵列筛选香蕉果实特异表达cDNA片段
2.1 材料与试剂
2.1.1 植物材料
2.1.2 试剂
2.1.3 质粒及菌种
2.1.4 抑制缩减文库构建
2.2 微阵列制作方法
2.2.1 SSH文库阳性质粒提取
2.2.2 SSH文库中重组克隆的鉴定
2.2.3 cDNA芯片制备
2.2.3.1 将鉴定出的重组质粒的插入片段进行PCR扩增
2.2.3.2 扩增的PCR产物纯化
2.2.3.3 点样
2.2.4 对样品的RNA进行标记
2.2.4.1 香蕉果实和根、茎叶的总RNA的提取
2.2.4.2 对样品的RNA进行标记
2.2.5 杂交与清洗
2.2.6 芯片扫描
2.2.6 芯片图像的采集与数据分析
2.2.6 芯片图像的采集与数据分析
2.3 结果
2.3.1 对阳性重组质粒进行PCR扩增
2.3.2 芯片分析结果
2.3.3 cDNA序列测定与BLAST分析
2.3.4 cDNA的功能分类
2.4 讨论
2.4.1 关于确定光吸收值的比例问题
2.4.2 关于未知功能和一些同源性比较低的cDNA片段
2.4.3 不同实验方法对分离低丰度基因的影响
3 果实特异表达基因cDNA Northern blot分析
3.1 材料与试剂
3.2 方法
3.2.1 RNA提取
3.2.2 杂交探针标记
3.2.2.1 随机挑选cDNA克隆
3.2.2.2 标记反应
3.2.3 杂交
3.2.3.1 转膜
3.2.3.2 Northern杂交
3.3 结果与讨论
3.3.1 cDNA表达的器官特异性
3.3.2 cDNA表达量的差异
3.3.3 Northern blot分析和芯片分析结果的一致性
4 香蕉果实a-1，4葡聚糖磷酸化酶基因克隆
4.1 材料与试剂
4.2 方法
4.2.1 香蕉果实RNA提取
4.2.2 香蕉果实第一链cDNA合成
4.2.3 RACE引物设计
4.2.4 RACE扩增BR63的5′端和3′端
4.2.4.1 Master Mix的准备(CLOTECH's Advantage 2 Polymerase Mix)
4.2.4.2 5′RACE反应体系
4.2.4.3 3′RACE反应体系
4.2.4.4 PCR程序
4.2.5 RACE产物的克隆及重组子筛选
4.2.5.1 回收5′、3′RACE特异性条带
4.2.5.2 回收PCR产物连接
4.2.5.3 连接产物转化E.coli DH5α
4.2.5.4 重组质粒DNA的微量提取
4.2.5.5 质粒DNA的大量提取
4.2.5.6 重组质粒酶切鉴定及测序
4.3 结果与讨论
4.3.1 基因克隆及测序
4.3.1.1 BR63片段5′、3′RACE扩增结果
4.3.1.2 序列测定
4.3.2 基因结构分析
4.3.3 基因同源性比较
4.3.4 利用RACE技术成功克隆到BR63的全长序列
4.3.4 不同方法克隆3′RACE扩增比较
5 a-1，4葡聚糖磷酸化酶基因在香蕉果实成熟过程中的表达
5.1 材料与试剂
5.2 方法
5.2.1 采后香蕉果实乙烯释放量及呼吸强度测定
5.2.1.1 材料处理
5.2.2 RT-PCR分析采后不同成熟阶段a-1，4葡聚糖磷酸化酶基因表达
5.2.2.1 RNA提取
5.2.2.2 cDNA第一连合成
5.2.2.3 RT-PCR反应
5.2.2.4 RT-PCR产物分析
5.3 结果
5.3.1 呼吸强度变化
5.3.2 乙烯释放量的变化
5.3.3 a-1，4葡聚糖磷酸化酶基因表达半定量PCR(RT-PCR)分析
5.3.4 The Scion Image软件分析表达结果
5.4 讨论
5.4.1 a-1，4葡聚糖磷酸化酶基因表达量与香蕉果实采后呼吸、乙烯变化的关系
5.4.2 a-1，4葡聚糖磷酸化酶基因在果实采后成熟过程中的表达
5.4.3 关于基因表达的半定量方法
6 香蕉果实特异表达启动子克隆
6.1 材料与试剂
6.1.1 植物材料
6.1.2 试剂
6.1.3 质粒及菌种
6.2 方法
6.2.1 香蕉凝集素(Banana Lectin，BanLec)基因表达研究
6.2.2 BanLec基因启动子的克隆
6.2.2.1 香蕉基因组DNA提取
6.2.2.2 香蕉基因组DNA酶切消化
6.2.2.3 酶切产物纯化
6.2.2.4 纯化后基因组DNA与GenomeWalker Adaptors连接
6.2.2.5 以GenomeWalker Libraries为模板的PCR
6.2.2.6 PCR产物回收
6.2.2.7 回收PCR产物连接和转化
6.2.2.8 重组质粒酶切鉴定及测序
6.3 结果
6.3.1 DNA提取及内切酶消化
6.3.2 启动子片断扩增及测序
6.3.3 启动子序列分析
6.4 讨论
6.3.1 克隆到的启动子序列的长度
6.3.2 启动子序列分析
7 凝集素基因启动子植物表达载体(pBIL2和pBIB2)的构建
7.1 材料与试剂
7.2 方法
7.2.1 植物表达载体pBIL2构建
7.2.1.1 BanLec基因启动子序列(命名为BL2)PCR扩增
7.2.1 植物表达载体pBIB2构建
7.2.1.1 芪合酶(命名为LAB)基因PCR扩增
7.2.2.2 LAB PCR产物回收、测序
7.2.2.3 LAB PCR回收产物及pBIL2表达载体BamH1、Sac1双酶切
7.2.1.2 回收酶切目的基因及载体片段
7.2.1.3 pBIB2载体连接
7.2.1.4 pBIB2载体转化大肠杆菌DH5α
7.2.1.5 质粒DNA微量提取及重组子的酶切鉴定
7.3 结果
7.3.1 BanLec基因启动子植物表达载体pBIL2的构建
7.3.2 芪合酶基因(LAB)克隆及测序
7.3.3 Banlec基因启动子连接芪合酶基因(LAB)表达载体pBIB2构建
8 凝集素基因启动子瞬时表达活性检测
8.1 材料与试剂
8.2 设备
8.3 方法
8.3.1 香蕉转化材料的准备
8.3.2 基因枪转化
8.3.2.1 质粒PBI121、pBIL2的大量提取
8.3.2.2 微弹制备(王关林等，2002)
8.3.2.3 基因枪轰击香蕉材料
8.3.3 GUS组织化学染色
8.3.4 GUS活性检测
8.3.4.1 GUS提取液的制备
8.3.4.2 GUS提取液蛋白含量测定
8.3.4.3 酶反应
8.4 结果与讨论
8.4.1 pBIL2载体在香蕉不同组织中瞬时表达结果
8.4.2 pBI121与pBIL2载体GUS活性检测
8.4.2.1 GUS提取液蛋白含量
8.4.2.2 转化24小时后一定时间内GUS酶活力变化
9 果实特异表达启动子启动芪合酶基因在番茄中的表达
9.1 材料与试剂
9.2 方法
9.2.1 pBIB2质粒导入农杆菌GV3103
9.2.2 PCR检测
9.2.3 GV3103介导的番茄遗传转化
9.2.4 转化番茄的鉴定
9.2.4.1 PCR检测
9.2.4.2 转化植株的Southern blot检测
9.2.4.3 转基因番茄RT-PCR检测
9.2.4.4 HPLC分析
9.3 结果
9.3.1 pBIB2转化番茄的出愈、分化、生根及大田种植
9.3.2 pBIB2转化番茄PCR检测及Southern blot分析
9.3.3 转基因植株RT-PCR检测
9.3.4 转化番茄植株白藜芦醇含量的测定
9.4 讨论
9.4.1 果实作为生物反应器的研究
9.4.2 白藜芦醇的生物学功能及转基因研究
9.4.3 BanLec基因启动子启动芪合酶基因在番茄中表达
9.4.4 构建含有葡萄芪合酶基因融合表达载体的意义
10 结论
参考文献
附录：
致谢
发布时间: 2005-07-27
参考文献
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