论文摘要
背景和目的:与处于终末期分化状态的骨骼肌细胞和心肌细胞不同,成年哺乳动物血管平滑肌细胞仍保持着高度的可塑性,当受到损伤时,可以发生可逆的表型转化。血管平滑肌细胞表型转化在人类多种疾病扮演着重要角色,如动脉粥样硬化、再狭窄、肺动脉高压和平滑肌肿瘤都与血管平滑肌细胞表型转化有着密切的关系。低氧可诱导肺动脉平滑肌细胞的表型转化,并且与多种信号分子有关,新近的研究表明血管紧张素II参与了低氧诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖。血管紧张素II是一种辛肽化合物激素,通过与细胞膜表面特异的受体结合,进而激活多种细胞内信号传导途径,发挥生物学效应。血管紧张素II受体有两种亚型,血管紧张素II 1型受体和血管紧张素II 2型受体,二者均为七次跨膜G蛋白偶联受体超家族成员。血管紧张素II与血管紧张素II 1型受体结合可激活JAK/STAT途径和促分裂素原活化蛋白激酶（如细胞外调节激酶）。血管紧张素II 1型受体在血管重建和平滑肌细胞表型转化过程中具有重要意义,并且低氧可影响其在心肌细胞和血管平滑肌细胞中的分布。目前已有的研究表明,血管紧张素II 1型受体功能的实现与其在胞内的运输密切相关。在内质网,血管紧张素II 1型受体经过合成、折叠、装配后,输送到高尔基体进行翻译后的修饰,然后被输送到细胞膜表面。目前针对血管紧张素II 1型受体如何从内质网经过高尔基体到达细胞表面的运输过程的研究较少。Rab蛋白,是GTPases的Ras超家族成员之一,与胞内蛋白在各细胞器之间的运输有关。Rab GTases被命名为小G蛋白,属于Ras超家族,已经发现有60多种Rab蛋白。Rab蛋白通过胞吐和胞吞的方式在囊泡运输中起重要作用,与其他Ras超家族成员一样,其功能通过与鸟嘌呤核苷酸结合时的分子转位实现。活性状态下（与GTP结合时）,Rab蛋白能通过特定的效应器来介导囊泡运输。目前研究表明,Rab1分布于内质网和高尔基体,并介导内质网至高尔基体的顺向蛋白运输,Rab1可调节内皮细胞和心肌细胞血管紧张素II 1型受体从内质网经高尔基体到细胞表面的表达。因此我们设想,可以通过调整Rab1介导的血管紧张素II 1型受体在肺动脉平滑肌细胞内的运输,进而调节肺动脉平滑肌细胞的表型转化和其他活性。本实验主要研究低氧状态下,Rab1对肺动脉平滑肌细胞血管紧张素II 1型受体分布及功能的影响,并探讨Rab1对肺动脉平滑肌细胞表型转化和其他功能的影响,为改善肺血管重建提供新的治疗思路。研究内容:1.采用肺内动脉组织贴块法培养大鼠肺动脉平滑肌细胞,通过光镜观察培养细胞特征性的形态,并使用特异性的α-SMA抗体进行免疫荧光染色鉴定。2.运用饱和配体测定法测定大鼠肺动脉平滑肌细胞经低氧处理后、慢病毒包装的Rab1WT或siRNA转染后血管紧张素II 1型受体在胞膜上的表达。3.使用激光共聚焦显微镜检测大鼠肺动脉平滑肌细胞转染慢病毒包装的Rab1WT和Rab1 siRNA后的血管紧张素II 1型受体在细胞膜和内质网的分布状况。4.采用Western Blot检测大鼠肺动脉平滑肌细胞转染慢病毒包装的Rab1WT和Rab1 siRNA后的血管平滑肌细胞标志分子（α-SMA和VIM）的表达情况和STAT3活性。5.细胞的增殖活性检测采用MTS分析法,细胞加入CellTiter 96? AQueous One Solution Cell Proliferation Assay后,使用酶标仪检测490nm的吸光度间接反映细胞的增殖活性。结果:1.组织块法培养大鼠肺动脉平滑肌细胞的鉴定结果显示:相差显微镜下,原代培养的细胞呈梭状,并呈峰-谷分布生长,抗α-SMA抗体间接免疫荧光染色呈阳性。2.正常对照组和低氧处理48 h后RPASMCs表面AT1R的表达量分别为556±61和725±83 cpm;常氧状态下,对照组、转染Rab1WT组和转染Rab siRNA组RPASMCs AT1R的表达值分别为550±69、804±130、301±46 cpm;低氧处理后,转染Rab1WT后的细胞AT1R的表达值738±98 cpm,转染Rab1 siRNA后的细胞AT1R的表达值仅为371±68 cpm（P <0.01）。3.转染Rab1WT后,血管紧张素II 1型受体主要在肺动脉平滑肌细胞胞膜上表达,而转染Rab1 siRNA后肺动脉平滑肌细胞,血管紧张素II 1型受体主要积聚在内质网。4.低氧处理以及使用血管紧张素II后,大鼠肺动脉平滑肌细胞STAT3酪氨酸磷酸化水平增加5.37倍,而转染Rab1 siRNA慢病毒后的细胞使用ZD7155（特异性的血管紧张素II 1型受体拮抗剂）后,其活性仅增加1.14倍（P<0.01）。5.低氧处理以及使用血管紧张素II后,大鼠肺动脉平滑肌细胞表型标志分子α-SMA和VIM含量明显减少,而转染Rab1 siRNA慢病毒后的细胞经ZD7155处理,其表型标志分子变化并不如此明显（P<0.05）。6.大鼠肺动脉平滑肌细胞经低氧处理以及使用血管紧张素II后,代表其增殖活性的OD值较常氧对照组增加159%,而转染Rab1 siRNA慢病毒后的细胞并使用ZD7155处理后,其OD值仅增加27%（P<0.01）。结论:1. Rab1蛋白可调节AT1R在大鼠肺动脉平滑肌细胞的分布,其机制可能是通过影响AT1R在胞内的囊泡运输。2. Rab1蛋白可调节AT1R介导的JAK/STAT信号转导途径。3. Rab1蛋白通过调节AT1R在大鼠肺动脉平滑肌细胞的分布,参与低氧诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞由分化型向去分化型的转化。4. Rab1蛋白参与调节大鼠肺动脉平滑肌细胞的增殖活性。综上所述,Rab1可以作为改善肺血管重建的潜在治疗靶点。
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