论文题目: 新型重组别藻蓝蛋白亚基的表达和生物活性的初步研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 海洋生物学
作者: 任育红
导师: 秦松
关键词: 重组别藻蓝蛋白,亚基,毕赤酵母,大肠杆菌,表达,抗氧化,升白细胞表位,细胞表位,预测
文献来源: 中国科学院研究生院（海洋研究所）
发表年度: 2005
论文摘要: 为了研究重组别藻蓝蛋白?镭普克(recombinant allophycocyanin,rAPC)的抗肿瘤机理及筛选更强的抗肿瘤蛋白,本实验进行了重组别藻蓝蛋白及其亚基基因分别在毕赤酵母和大肠杆菌中的表达、表达产物的性质及生物活性的初步研究。 将 apc 克隆到表达载体 pPIC6αA 中,用氯化锂法转化毕赤酵母菌株 X-33,Western blot 检测工程菌的培养基上清液,表明重组别藻蓝蛋白(YAPC)由两种亚基组成,相对分子质量分别为 19kD 和 21kD;5 mmol/L LaCl3使表达量提高110%,同时缩短了最适培养时间,摇瓶培养 48h 最高表达量为 4.4 mg/L。 重组大肠杆菌 P2、P3 和 PMBP 表达的新型重组别藻蓝蛋白亚基 MαAPC 和 MβAPC 以及 rMBP,用 Amylose 亲和层析分离纯化,经 SDS-PAGE 和 HPLC 检验纯度达 88%以上;相对分子质量分别为 61kD,61kD 和 43kD;最大吸收波长分别为 275nm、285nm 和 281nm;经 Western blotting 检测,MαAPC和 MβAPC具有与天然 APC 相同的免疫原性。 含 pET-28a/APC 载体的大肠杆菌 P4表达的重组别藻蓝蛋白 HAPC,经金属螯合亲和层析法分离纯化,纯度达 90%以上;其α亚基和β亚基的相对分子质量分别为 21kD 和 17kD;HAPC 最大吸收波长为 235nm;具有与天然 APC 相同的免疫原性;邻二氮菲—Fe2+氧化法和邻苯三酚自氧化反应速度测定结果显示:HAPC 具有较强的清除羟自由基和超氧阴离子自由基的能力;药理生理学实验结果显示:HAPC 具有显著升高白细胞活性和一定的肿瘤抑制活性。 运用 MAPPP 和 ProPred 及 ABCpred 服务器对 HAPC 和 rMBP 中的 T 细胞表位和 B 细胞表位进行了预测,结果显示两种重组蛋白都有多种通用 T 细胞表位和 HLA 限制性表位及 B 细胞表位,提示具有免疫促进功能,为确定免疫药理靶点奠定了基础,可作为多抗原肽疫苗有一定的应用前景。 本文实现了重组别藻蓝蛋白基因在毕赤酵母中的异源表达。首次发现 LaCl3可增加毕赤酵母表达系统的表达水平,从而有效地降低成本并缩短生产流程。重组别藻蓝蛋白及亚基的表达、纯化方法的建立及生物活性的初步分析,为深入研究重组别藻蓝蛋白的抗肿瘤机理以及开发基因工程新药奠定了基础。
论文目录:
摘要
Abstract
第一章 引言
第一节 藻胆蛋白研究进展
1 藻胆蛋白的结构
2 藻胆蛋白分子的进化
3 藻胆蛋白的应用研究
3.1 作为天然色素
3.2 作为饲料
3.3 作为荧光探针
3.4 作为药品或保健品
4 藻胆蛋白生物活性的分子机制研究
5 藻胆蛋白的基因工程
第二节 巴斯德毕赤酵母表达系统的研究进展
1 受体菌株
2 表达载体
2.1 常见的表达载体
2.2 载体元件的发展
3 外源蛋白在毕赤酵母中的表达
3.1 表达的一般步骤
3.2 重组蛋白的分泌表达
3.3 重组蛋白的翻译后加工修饰
3.4 影响酵母表达的因素
第三节 T 细胞表位预测研究进展
1 免疫学的基本概念
2 T 细胞表位预测
2.1 T 细胞表位预测的分子基础
2.2 细胞毒性 T 淋巴细胞抗原表位的预测
2.3 辅助性 T 细胞抗原表位的预测
第四节 本论文工作研究的目标、意义及总体路线
1 新型重组别藻蓝蛋白亚基表达载体的构建及表达
2 基因工程菌株的摇瓶培养及发酵罐高密度发酵
3 纯化方法及质控标准的探索
4 生物活性的研究
5 作用机理的初步研究
第二章 重组别藻蓝蛋白基因在毕赤酵母中的表达
1 材料与方法
1.1 载体及菌株
1.2 生化试剂
1.3 培养基
1.4 毕赤酵母表达载体pPIC6αA/APC 的构建
1.5 别藻蓝蛋白基因在毕赤酵母中的融合表达
1.6 重组 APC 的免疫原性检测
1.7 重组 APC 表达条件的优化——LaCl_3 对毕赤酵母表达 YAPC 的影响
2 结果
2.1 毕赤酵母表达载体pPIC6αA/APC 的构建
2.2 别藻蓝蛋白基因在毕赤酵母中的融合表达
2.3 YAPC 的免疫原性检测
2.4 LaCl_3 对YAPC 在毕赤酵母中表达的影响
3 讨论
4 小结
第三章 新型重组别藻蓝蛋白亚基的表达﹑纯化及性质研究
第一节 重组别藻蓝蛋白亚基基因在大肠杆菌中的表达及纯化
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 实验方法
2 结果与讨论
2.1 重组质粒的构建及核苷酸序列测定
2.2 重组蛋白的分离纯化
3 小结
第二节 新型重组别藻蓝蛋白亚基及重组麦芽糖结合蛋白的性质研究
1 材料与方法
1.1 高效液相层析色谱（HPLC）
1.2 重组蛋白的最大吸收波长测定
1.3 免疫印迹(Western blotting)分析
1.4 重组蛋白抗氧化活性的测定
2 结果与讨论
2.1 HPLC 检测
2.2 最大吸收波长的测定
2.3 免疫原性检测
2.4 目的蛋白抗氧化活性的测定
3 小结
第四章 重组别藻蓝蛋白基因在大肠杆菌中的表达﹑纯化及生物活性的初步研究
第一节 重组别藻蓝蛋白基因在大肠杆菌中的表达﹑纯化及性质研究
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 实验方法
2 结果与讨论
2.1 重组质粒的构建及核苷酸序列测定
2.2 重组蛋白的分离纯化
2.3 HPLC 检测
2.4 最大吸收波长的测定
2.5 免疫原性检测
3 小结
第二节 重组别藻蓝蛋白(HAPC)生物活性的初步研究
1 材料与方法
1.1 药物
1.2 动物和瘤株
1.3 抗氧化活性测定——邻二氮菲—Fe~(2+)氧化法
1.4 HAPC 对正常小鼠化疗致白细胞数下降的对抗作用
1.5 HAPC 对荷瘤小鼠的升白、抑瘤作用
1.6 其他方法
2 结果
2.1 HAPC 抗氧化活性的测定
2.2 HAPC 对正常小鼠化疗致白细胞数下降的对抗作用
2.3 HAPC 对荷瘤小鼠化疗致白细胞(WBC)数下降的对抗作用
3 讨论
4 小结
第五章 重组别藻蓝蛋白的抗原表位预测
1 材料与方法
1.1 靶抗原
1.2 CTL 表位预测
1.3 打分矩阵法（Quantitative Matrices）
1.4 B 细胞表位预测
2 结果
2.1 MHC-I 类 T 细胞表位的预测
2.2 MHC-II 类T 细胞表位的预测
2.3 B 细胞表位的预测
3 讨论
4 小结
结论
使用仪器
参考文献
发表及已接收文章目录
致谢
发布时间: 2005-07-05
参考文献
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