过氧化氢对山羊精子质膜功能完整性、顶体酶、获能以及核DNA的影响

论文摘要

目的：过氧化氢能够调节精子获能，并且会影响精子的其他功能以及精子核DNA的完整性。本实验拟通过添加外源性过氧化氢，观察其对山羊精子顶体反应、顶体酶、精子膜完整性以及DNA损坏的影响，为过氧化氢影响精子功能的机制提供一定的理论依据。方法：本实验主要通过检测精子顶体反应率、质膜功能完整性、顶体酶阳性率、活率以及核DNA损伤阳性率等5个指标来反映过氧化氢对精子部分功能的影响。实验共分为五部分，第一部分采用过氧化氢与上游法获得的优质精子共同体外孵育，来观察不同浓度的过氧化氢对精子上述前四个指标的影响；第二部分采用20μM浓度的过氧化氢与精子共同体外孵育，来观察添加过氧化氢后，孵育时间对精子上述指标的影响；第三部分利用试剂盒检测精液各成分中过氧化氢的去除剂——过氧化氢酶(CAT)的活性，通过去除精浆与添加CAT的实验从侧面证明过氧化氢对精子功能的影响；第四部分采用20μM浓度的过氧化氢与不同山羊个体的精子共同体外孵育，来判断过氧化氢对不同个体的精子是否有不同的影响；第五部分利用单细胞凝胶电泳实验检测不同过氧化氢浓度下对精子核DNA的影响，以及冰箱低温保存后复温精子核DNA损伤的情况。结果：1、当过氧化氢浓度在10μM和20μM之间，精子的脂膜功能完整性、顶体酶阳性率以及精子活率没有显著的改变(P＞0.05)；而当添加20μM浓度的过氧化氢诱导精子获能的效果要极显著地高于其它浓度(P＜0.01)。当过氧化氢添加到50μM时，各个指标均显著下降，差异达到极显著水平(P＜0.01)。把过氧化氢的量最终加到100μM时，各个指标的值继续下降；2、精子在37℃下孵育后，弯尾率1h组与2h组相比，差异不显著(P＞0.05)。发生顶体反应的精子数量在第3h到达最大值，其它指标均在2h时达到最大值，并且弯尾率和活率在3～4h内比在2～3小时内下降的更快；3、山羊精液中含有CAT(过氧化氢酶)，在精浆和精子中分别是216.25±3.9455U／(10~8个／ml)和12.12±2.3293U／(10~8个／ml)。当把精液中的精浆去除以后精子各个指标均极显著下降(P＜0.01)。向精子中添加200IU的CAT时，可以极显著地提高各个指标(P＜0.01)。但是当CAT增加到400IU时，各个指标变化不明显；4、20μM的过氧化氢对不同的山羊个体影响差异不显著(P＞0.05)；5、随着过氧化氢浓度的增加，精子核DNA损伤阳性率不断增加，当浓度达到50μM时，精子核DNA损伤率达到30％以上。经过冰箱低温保存的精子，其核DNA的损伤率随着保存时间的延长而逐渐增加，但增加幅度不明显(P＞0.05)。结论：低浓度的过氧化氢可以促进精子获能，对精子其它功能的作用不明显。高浓度的过氧化氢会显著地影响精子的功能；在一定范围内，过氧化氢酶能很好地保护精子。精浆作为一种天然的保护剂，对精子起到了很好的保护；低浓度的过氧化氢对身体健康、精液质量正常的公羊的精液影响效果一致；低温保存时间对精子核DNA影响不大，其前提是保存的精液的质量必须正常。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 文献综述
• 1.1 活性氧族简介
• 1.2 过氧化氢胞内来源
• 1.3 过氧化氢对精子的影响
• 1.3.1 过氧化氢对精子获能的影响
• 1.3.2 过氧化氢对精子核DNA的影响
• 1.3.3 过氧化氢对精子质膜功能完整性的响
• 1.3.4 过氧化氢对精子顶体酶的影响
• 1.4 过氧化氢的去除
• 1.5 精子核DNA链断裂的检测
• 1.6 精子质膜完整性的检测
• 1.6.1 常规染色
• 1.6.2 荧光探针染色法
• 1.6.3 低渗肿胀试验
• 1.7 精子顶体反应的检测
• 2 研究的提出及其目的和意义
• 3 试验材料和方法
• 3.1 试验材料
• 3.2 主要仪器设备
• 3.3 主要试剂
• 3.4 精液的采集
• 3.5 精液获能的培养
• 3.6 顶体酶阳性率的检测
• 3.7 精子膜功能完整性的检测
• 3.8 过氧化氢酶的测定
• 3.9 DNA损伤的检测
• 3.10 试验设计
• 3.10.1 试验一
• 3.10.2 试验二
• 3.10.3 试验三
• 3.10.4 试验四
• 3.10.5 试验五
• 3.10.6 试验六
• 3.11 数据统计分析
• 4 结果与分析
• 4.1 不同浓度的过氧化氢对精子的影响
• 4.2 不同培养时间对精子的影响
• 4.3 过氧化氢酶对精子的影响
• 4.3.1 精液中过氧化氢酶活性的测定
• 4.3.2 精浆对精子的保护作用
• 4.3.3 添加过氧化氢酶对精子的影响
• 4.4 过氧化氢对不同山羊个体精子的影响
• 4.5 过氧化氢对精子核DNA的影响
• 4.5.1 不同浓度过氧化氢对精子核DNA的影响
• 4.5.2 冰箱低温保存对精子核DNA的影响
• 5 讨论
• 5.1 过氧化氢对精子顶体反应率的影响
• 5.2 过氧化氢对精子脂膜功能完整性的影响
• 5.3 过氧化氢酶对精子的影响
• 5.4 过氧化氢对精子顶体酶的影响
• 5.5 过氧化氢对精子核DNA的影响
• 5.6 过氧化氢对不同山羊个体精子的影响
• 6 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录1
• 附录2