家蚕膜蛋白Baxinhibitor-1与多角体蛋白融合在家蚕杆状病毒表达系统中的表达及鉴定

论文摘要

家蚕杆状病毒核型多角体蛋白（polyhedron, Polh）是昆虫杆状病毒的重要结构蛋白,其在外界极稳定,能保护病毒粒子免受物理和生化降解。将野生杆状病毒感染家蚕BmN细胞,待发病后收集细胞,根据天然Polh能溶解在碱性溶液中的性质,用pH 10.8的缓冲液溶解发病细胞裂解后的沉淀,离心,得到的上清中Polh含量达85%以上,通过阴离子交换柱和分子筛进一步纯化,得到纯度高达99%以上的天然Polh。将纯化的Polh免疫小鼠获得特异性高的多克隆抗血清,以此抗体作为一抗,通过Western blotting方法检测融合Polh的融合蛋白的表达。多角体蛋白基因作为融合伴侣与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因融合构建到原核表达载体pET-28a中,并在二者之间引入一个烟草蚀纹病毒（tobacco etch virus, TEV）蛋白酶酶切位点,使其在E.coli中表达,发现表达的重组蛋白显示了与天然多角体蛋白几乎完全一样的特性,在碱性缓冲液下快速的溶解,而且形成了稳定且易于分离的包涵体。通过差速离心与缓冲液pH变化,分离纯化得到Polh-EGFP融合蛋白,其纯度高达95%,融合蛋白的得率为79.3%。再用TEV酶切除多角体标签,获得纯的EGFP。本实验成功建立了原核表达的基于多角体蛋白融合的快速高效的纯化方案。Bax inhibitor-1（BI-1）是一种包含多个跨膜结构域的抗凋亡蛋白,其蛋白家族中的成员定位于内质网膜,通过Bcl-2调节细胞的凋亡。我们对本实验室构建的家蚕cDNA文库进行筛查时,发现一条与小鼠Bax inhibator-1有52%同源性的基因,生物信息学分析后,初步命名为BmBI-1（家蚕Bax inhibator-1）, GenBank登录号是DN237509。为了进一步证实多角体基因在融合表达与纯化中的优势,将BmBI-1与Polh在家蚕杆状病毒表达系统进行融合表达。首先利用杆状病毒载体pFastBac HTb作为转座载体,将Polh-BmBI-1基因转座到杆状病毒基因组（Bacmid）上,构建Bacmid-Polh-BmBI-1。然后通过脂质体将Bacmid-Polh-BmBI-1转染家蚕BmN细胞得到重组病毒vBmPolh-BmBI-1 。以扩增后的重组病毒感染家蚕细胞,收集发病细胞,Western blotting和荧光定量PCR分析发现,Polh-BmBI-1基因在家蚕细胞中成功表达而作为对照的未融合Polh的BmBI-1无法表达。最后,将重组病毒vBmPolh-BmBI-1接种于五龄家蚕幼虫体内,待大部分蚕出现明显病毒感染症状后,大量收集蚕血淋巴。Western blotting检测发现Polh-BmBI-1融合蛋白在家蚕幼虫及蛹中成功表达,表达产物分子量在60 kDa左右,和融合蛋白预测的分子量一致。荧光定量PCR结果显示,在病毒感染细胞72 h后蛋白表达量最高。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语
• 第一部分 文献综述与实验设计
• 第一章 背景综述
• 第一节 膜蛋白研究的困难
• 第二节 昆虫杆状病毒表达载体系统的研究进展
• 1 杆状病毒的形态和结构
• 2 杆状病毒表达系统
• 2.1 杆状病毒表达系统与大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞三种表达系统比较
• 2.2 家蚕/BmNPV表达系统相对于Sf细胞/AcMNPV表达系统的优势
• 2.3 大肠杆菌一昆虫细胞穿梭载体系统（Bac-to-Bac）
• 2.4 杆状病毒表达系统的进展及展望
• 3 多角体蛋白
• 第三节 Bax inhibitor-1的研究进展
• 1 BI-1基因的发现及分子结构
• 2 BI-1的表达与分布及进化保守性
• 3 BI-1的功能
• 3.1 BI-1的抗凋亡功能
• 3.2 BI-1的离子通道功能
• 3.3 BI-1在植物中的作用
• 3.4 BI-1与发育
• 4 BI-1基因与肿瘤
• 5 展望
• 第二章 实验方案设计
• 1 实验目的和意义
• 2 研究内容
• 3 实验流程图
• 第二部分 研究论文
• 第一章 天然Polh的纯化及多克隆抗体的制备
• 1 材料与试剂
• 1.1 材料
• 1.2 试剂
• 1.3 试剂配制
• 2 方法
• 2.1 细胞培养与冻存、复苏
• 2.2 病毒的扩增培养
• 2.3 病毒滴度测定（终点稀释法）
• 2.4 天然Polh的纯化
• 2.5 SDS-PAGE电泳分析
• 2.6 Polh多克隆抗体的制备
• 2.7 Western blotting检测
• 3 结果
• 3.1 天然Polh的粗纯结果
• 3.2 过RESOUCE Q进一步纯化
• 3.3 过HiPrep26/10脱盐柱交换缓冲液
• 3.4 质谱分析
• 3.5 Western blotting检测
• 4 讨论
• 第二章 快速高效的纯化与Polh融合的目标蛋白方法的建立
• 1 材料和试剂
• 1.1 材料
• 1.2 试剂
• 1.3 主要试剂的配制
• 2 方法
• 2.1 克隆实验设计
• 2.2 Polh基因的克隆
• 2.3 EGFP基因的克隆
• 2.4 序列测定
• 2.5 重组质粒的转化及鉴定
• 2.6 重组质粒在大肠杆菌中表达
• 2.7 SDS-PAGE电泳分析
• 2.8 融合蛋白的纯化
• 2.9 TEV酶酶切纯化后的融合蛋白
• 2.10 TEV酶酶切后EGFP的纯化
• 2.11 Western blotting分析酶切后各组份
• 3 结果
• 3.1 Polh基因的克隆结果
• 3.2 EGFP基因的克隆结果
• 3.3 序列测定
• 3.4 Polh-EGFP的诱导表达
• 3.5 Polh-EGFP的纯化
• 3.6 融合蛋白的TEV酶酶切
• 3.7 TEV酶酶切后EGFP的纯化
• 3.8 Western blotting分析酶切后各蛋白
• 4 讨论
• 第三章 家蚕Bax inhibitor-1基因的生物信息学分析
• 1 序列与工具
• 1.1 序列
• 1.2 工具和软件
• 2 方法
• 2.1 BmBI-1基因的获得
• 2.2 BmBI-1基因的序列分析
• 3 结果
• 3.1 BmBI-1基因的序列
• 3.2 疏水性分析
• 3.3 跨膜区和信号肽分析
• 3.4 二级结构的预测
• 3.5 BmBI-1蛋白高级结构的预测
• 3.6 功能位点分析
• 3.7 BmBI-1氨基酸序列同源性分析
• 4 讨论
• 第四章 家蚕Bax inhibitor-1基因融合Polh基因在家蚕杆状病毒表达系统中的表达
• 1 材料与试剂
• 1.1 材料
• 1.2 试剂
• 1.3 试剂配制
• 2 方法
• 2.1 重组质粒pFastBac HTb-Polh的构建
• 2.2 重组供体质粒pFastBac HTb-Polh-BmBI-1与pFastBac HTb-BmBI-1的构建及鉴定
• 2.3 重组病毒基因组Bacmid-Polh-BmBI-1与Bacmid-BmBI-1的构建
• 2.4 细胞培养与冻存、复苏
• 2.5 重组病毒vBmPolh-BmBI-1与vBmBmBI-1的构建
• 2.6 目的蛋白Polh-BmBI-1和BmBI-1在家蚕BmN细胞中的表达和鉴定
• 2.7 融合蛋白Polh-BmBI-1在重组病毒感染的细胞中的表达时相
• 2.8 融合蛋白Polh-BmBI-1在家蚕五龄幼虫及蚕蛹中的表达和鉴定
• 3 结果
• 3.1 重组供体质粒pFastBac HTb-Polh-BmBI-1与pFastBac HTb-BmBI-1的
• 3.2 重组Bacmid PCR鉴定
• 3.3 重组病毒vBmPolh-BmBI-1与vBmBmBl-1的PCR鉴定
• 3.4 PT-PCR及Western blotting鉴定Polh-BmBI-1和BmBI-1蛋白在家蚕细胞中的表达情况
• 3.5 融合蛋白Polh-BmBI-1在重组病毒感染的细胞中的表达时相
• 3.6 Western blotting鉴定融合蛋白Polh-BmBI-1在家蚕幼虫及蚕蛹中的表达
• 4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢