论文摘要
目的意义:严重烧伤后造成肠粘膜血流量下降,肠粘膜组织损伤及通透性增加,使肠道屏障功能障碍,造成肠道细菌移位,引发多器官功能障碍,是导致伤后高代谢的重要原因。因此促进严重烧伤后肠道修复,能减轻脏器炎症反应,防止肠源性感染,改善代谢障碍,加快创面愈合,是临床救治重要措施之一。肠道作为人体最大的内分泌器官,其自身分泌许多肠道激素对肠道结构功能起着重要的保护作用,随着近年来对胰高血糖素样多肽-2（Glucagons like peptide 2,GLP-2）认识的不断深入,发现其对肠道有特异性保护作用。且有广泛临床应用前景。本研究利用基因重组技术设计构建了GLP-2原核表达载体并诱导表达,初步观察其对烧伤后大鼠肠道及肠上皮细胞的保护作用,利用体外细胞模型,探讨GLP-2促细胞增殖的作用机制及调控因素,为今后临床应用提供理论依据。材料与方法:1.利用pET31b（+）表达载体,对GLP-2序列进行重组设计,构建表达质粒进行原核表达,优化条件后表达并进行亲和层析纯化、脱盐。溴化氰裂解后行western blot（WB）鉴定,并低温干燥保存。2.采用30%TBSAⅢ度烧伤大鼠模型作为体内实验模型,随机分为正常对照组（N）;烧伤对照组（C）;重组GLP-2治疗组（Gr）及化学合成GLP-2治疗组（G）。检测大鼠伤后第7天肠粘膜通透性,肠粘膜湿重与肠段及躯壳重比,肠粘膜蛋白及肠道病理形态学的变化。RT-PCR及WB检测GLP-2R的表达,利用脂质体基因转染构建稳定表达GLP-2R的Caco-2/GLP-2R（+）细胞作为体外研究模型,随机分为正常对照组（N）;缺氧对照组（C）;缺氧后重组GLP-2处理组（Gr）及缺氧后化学合成GLP-2处理组（G）。观察不同GLP-2对缺氧后细胞增殖、乳酸脱氢酶及蔗糖酶活性的影响,并检测细胞CDK4及ZO1蛋白表达的变化。3.构建caveolin-1/pEGFPN2质粒及体外合成caveolin-1 siRNA后瞬时转染Caco-2/GLP-2R（+）细胞,将细胞分为正常对照组（AN）、缺氧对照组（AC）、缺氧后GLP-2处理组（AG）、caveolin-1上调细胞缺氧后GLP-2处理组（CG）、caveolin-1下调细胞缺氧后GLP-2处理组（EG）,检测细胞cAMP浓度,GRK2（ser280）磷酸化蛋白变化及细胞增殖,同时应用信号通路抑制剂观察GLP-2信号转导,WB检测ERK信号转导通路中相关蛋白及Akt（ser473）蛋白磷酸化表达的变化,免疫共沉淀检测caveolin-1与GLP-2R的作用,。观察GLP—2对缺氧后细胞增殖信号转导途径的影响以及caveolin-1对GLP-2R跨膜信号的调控结果:1.成功设计构建GLP-2/pET31b（+）质粒质粒,测序正确;在BLR（DE3）感受态大肠杆菌种诱导表达最佳条件为1mMIPTG诱导表达4h,通过亲和层析纯化及溴化氰裂解法获得单体GLP-2约100mg,重组得率5mg/100ml。2.给予重组GLP-2及合成GLP-2后,烧伤后第7天,与烧伤对照组相比,大鼠的肠粘膜通透性明显降低,肠粘膜蛋白含量、肠粘膜与肠段重及与躯壳重之比均明显升高（P＜0.05）,而两种GLP-2之间差异无显著性意义（P＞0.05）。形态学观察两种GLP-2均能减轻烧伤后肠粘膜病理损伤。体外实验结果显示,细胞严重缺氧8h立即加入1000nM的GLP-2,24、72h后能够明显增加Caco-2/GLP-2R（+）细胞的细胞增殖（P＜0.05）,重组GLP-2与合成GLP-2效果无明显差别（P＞0.05）。而GLP-2处理72小时后,细胞乳酸脱氢酶及蔗糖酶活性无明显变化（P＞0.05）。CDK4及ZO1蛋白表达较缺氧对照组增强。缺氧后立即给予1000nM的GLP-2处理,24h后,缺氧对照组cAMP含量明显降低（P＜0.01）,而GLP-2处理组的cAMP却维持在一个较高水平。CG组细胞的cAMP明显增加,而EG组cAMP含量下调。GLP-2处理24h后,能够明显增加缺氧细胞的增殖（P＜0.05）,在CG组细胞增殖更加明显（P＜0.05）,EG组增殖作用下降。GLP-2处理后30min,磷酸化GRK2蛋白表达较缺氧对照组增强,无论上调或下调caveolin-1后,磷酸化GRK-2表达下降。给予不同信号通路抑制剂后发现,MEK1/2特异性抑制剂U0126及PI3特异抑制剂LY294002能够明显抑制GLP-2的促增殖作用（P＜0.05）,而P38特异性抑制剂SB203580却不能抑制GLP-2促增殖作用。。缺氧后给予GLP-2能增强ERK信号途径中c-Raf、MEK1/2、ERK1/2及核内p90RSK磷酸化蛋白的表达,也能增强PI3信号途径中Akt磷酸化蛋白的表达。caveolin-1上调后ERK信号通路中相关磷酸化蛋白的表达增强增强,caveolin-1下调后相关磷酸化蛋白的表达减弱。结论:1.构建GLP-2原核表达载体。诱导表达纯化,为GLP-2获得提供了一种新的方法。2.重组GLP-2及化学合成GLP-2能够降低严重烧伤后大鼠肠粘膜通透性,增加粘膜重量及蛋白含量,减轻肠粘膜的损伤程度。对Caco2/GLP-2R（+）细胞具有明显的促增殖作用,但对细胞无明显毒性,对蔗糖酶活性没有明显的影响,能够增强缺氧后细胞CDK4及ZO1蛋白表达,可能参与了细胞分裂及细胞间紧密连接的调控机制。3.GLP-2对细胞的促增殖作用伴有cAMP的增加,而磷酸化GRK2蛋白负反馈机制可能参与了对cAMP的调控。GLP-2对细胞增殖的作用依赖于ERK及PI3途径,其可以引起c-Raf,MEK1/2,ERK1/2及P90RSK磷酸化蛋白表达增强,也使Akt磷酸化蛋白表达增强。而可能不依赖于P38信号途径。Caveolin-1对GLP-2R信号转导可能有调控作用,本实验中,其可促进GLP-2介导的细胞增殖及激活ERK,PI3信号途径。
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