温度胁迫下番茄内质网ω-3脂肪酸去饱和酶基因的表达和功能研究

论文摘要

温度是限制植物生长发育及地理分布的重要环境因子之一。当植物遭受温度胁迫时,生物膜是伤害的初始位点。植物体膜脂不饱和脂肪酸含量越高,膜脂相变温度就越低,低温抗性就越强。反之,则相变温度越高,高温抗性越强。ω-3脂肪酸去饱和酶FAD3位于内质网膜上,负责质体膜内膜膜脂之外及非光合组织中所有不饱和甘油酯的合成,是不饱和脂肪酸合成途径中催化18:2（9,12）转化为18:3（9,12,15）的关键酶。本研究从番茄中分离到内质网ω-3脂肪酸去饱和酶基因。表达模式和功能分析表明,该基因的表达受低温诱导,受高温抑制。过量表达该基因增强番茄植株的耐冷性,而抑制该基因表达可提高番茄植株的耐热性。主要结果如下:1.利用同源序列设计简并引物,先通过RT-PCR的方法从番茄叶片克隆到内质网ω-3脂肪酸去饱和酶基因的中间片段,然后采用RACE的方法分别克隆到5′片段和3′片段,拼接后设计特异引物扩增到全长cDNA。该基因全长为1184 bp,ORF为1134 bp,编码377个氨基酸,分子量约为41 kD。将其在GenBank注册,注册号为EU251190。2.同源序列比较发现,番茄内质网ω-3脂肪酸去饱和酶基因的序列与烟草、油棕、大豆和芥菜型油菜的内质网型ω-3脂肪酸去饱和酶基因同源性很高。同时,进化树分析表明,该基因聚类到内质网型FAD3类ω-3脂肪酸去饱和酶,因此将其命名为LeFAD3基因。结构同源性分析表明LeFAD3有四个序列保守的结构域,其中后三个保守区富含组氨酸,是维持其膜结合类酶特性所必须的。3. Southern杂交结果表明,LeFAD3基因在番茄基因组中是单拷贝的,是编码番茄ω-3脂肪酸去饱和酶多基因家族中的一员。Northern杂交结果表明,LeFAD3基因在不同器官中呈非特异性表达,在非光合组织中表达量较高,尤以根系中表达量最高,叶片中较少。同时,该基因在生长温度范围内（4-40℃）均有表达,受低温诱导,高温胁迫抑制其表达。4.将获得的LeFAD3基因与含有35S启动子的pBI121载体重组,分别构建了正义和反义表达载体,利用农杆菌介导的叶盘法转入番茄中,通过5‰的卡那霉素筛选,获得了转基因番茄植株。用PCR及Northern杂交的方法对带卡那抗性的转基因番茄植株进一步检测,结果证明目的基因已经整合到部分转基因苗的基因组中,成功地获得了转正义和反义LeFAD3基因的番茄植株。过量表达LeFAD3基因的转基因植株根系与叶片膜脂中18:3含量明显升高,而18:2含量相应降低,脂肪酸不饱和度升高。而LeFAD3基因表达发生沉默的转基因植株中18:2含量明显增加,18:3含量相应下降,脂肪酸饱和度升高。5.构建了原核表达载体pET-LeFAD3,并在大肠杆菌BL21中表达融合蛋白,免疫小白鼠,制备抗体,其抗血清效价为1:500。Western杂交表明,转正义植株中LeFAD3基因已在蛋白水平过量表达。6.转正义基因植株比野生型具有较高的抗冷性。低温16℃/8℃处理30天后,转正义基因植株比野生型的生长量高。低温（4℃）胁迫条件下处理0、3、6、9、12 h后,相对电导率升高,但是野生型比转正义基因植株增加的幅度大;低温胁迫后,与野生型相比,由于转正义基因植株膜脂脂肪酸不饱和程度增加,叶片的叶绿体膜和根尖细胞内的各个亚细胞器膜系统保持较完整,受到的损伤轻;低温胁迫下,转正义基因株系与野生型叶片放氧活性和Fv/Fm均下降,转基因株系下降幅度小,4℃处理12 h后,野生型以及转正义基因株系T1-16,T1-20和T1-6的放氧速率分别降低到原来的22.9 %, 32%,32.2 %和38.3 %。低温胁迫12 h后,野生型,T1-16,T1-20和T1-6株系的Fv/Fm分别降低了47.6 %,33.5%,29.7 %和14.8 %;转正义基因番茄株系与野生型叶片和根系呼吸速率先上升后下降,其中野生型下降幅度大。这些结果表明,在低温条件下类囊体膜18:3含量的增加对光系统有保护作用,能提高番茄植株的低温抗性。野生型和转正义基因植株的SOD和APX活性在低温胁迫过程中先升高后降低,低温处理12 h后,转正义基因植株的SOD和APX活性高于野生型。野生型番茄的O2-|-和H2O2的含量在低温处理后增加,而转正义基因植株的O2-|-和H2O2含量在处理6 h后才增加,而且野生型O2-|-和H2O2含量增加的程度明显高于转基因植株。胁迫结束时,野生型,T1-16, T1-20和T1-6的O2-|-含量分别增加了53%,47%,32%和19%,而H2O2含量分别增加了79%, 43%,35%和28%;MDA含量分别升高了146%,114%,100%和87%。7.转反义基因植株比野生型具有较强的耐热性。高温（40℃）处理下,转反义基因植株比野生型的生长量高。40℃胁迫处理0、3、6、9、12 h后,相对电导率都升高,但是野生型比转反义基因植株增加的幅度大;高温处理12 h后,野生型叶绿体变圆并出现过氧化物体,其中有菱形的结晶物,叶片和根尖细胞内都出现脂滴,而转反义基因植株仍能保持较完整的膜系统,损伤程度较低;转反义基因株系与野生型叶片放氧活性和Fv/Fm均下降,其中转基因株系下降幅度小,40℃处理12 h后,野生型以及转反义基因株系T1-10,T1-8和T1-5的放氧速率分别降低到原来的21.0 %, 33.5 %,36.2%和45.5 %。高温胁迫12 h,野生型,T1-10, T1-8和T1-5株系的Fv/Fm分别降低了33%,28 %,21%和8.9%。转反义基因株系与野生型叶片和根系呼吸速率均下降,其中野生型株系下降幅度大。在高温处理过程中,野生型植株和转反义基因植株的SOD和APX活性先升高后降低。高温处理过程中,转反义基因植株的SOD和APX活性高于野生型。野生型植株的O2-|-和H2O2的含量在高温处理3 h后开始增加,而转反义基因植株的O2-|-和H2O2含量在处理6 h后才增加,而且野生型的O2-|-和H2O2含量增加的程度明显高于转基因植株。胁迫结束时,野生型,T1-10, 1-8和T1-5的O 2含量分别增加了78%,68%, 63%和14%,而野生型,T1-10, T1-8和T1-5的H2O2含量分别增加了70%, 55.6%, 48%和22.8%。高温处理过程中,野生型和转反义基因植株中MDA含量都增加,野生型中MDA含量增加更为显著。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩写符号及中英文对照表
• 1 引言
• 1.1 植物生物膜的组成
• 1.2 低温胁迫对植物的影响
• 1.2.1 低温对植物生物膜的影响
• 1.2.2 低温对植物光合作用的影响
• 1.2.3 低温光抑制的生化保护机制
• 1.3 高温胁迫对植物的影响
• 1.3.1 高温对植物生物膜的影响
• 1.3.2 高温对植物光合作用的影响
• 1.3.3 高温光抑制的生化保护机制
• 1.4 多不饱和脂肪酸的合成
• 1.4.1 多不饱和脂肪酸的种类
• 1.4.2 多不饱和脂肪酸的生物合成
• 1.4.2.1 C20-22 PUFAs 的生物合成
• 1.4.2.2 C16-18 PUFAs 的生物合成
• 1.5 脂肪酸去饱和酶的研究
• 1.5.1 除ω-3 脂肪酸去饱和酶外的脂肪酸去饱和酶的研究
• 1.5.2 ALA 合成过程中关键酶ω-3 脂肪酸去饱和酶的研究
• 1.5.2.1 ω-3 脂肪酸去饱和酶的种类、分布和性质
• 1.5.2.2 ω-3 脂肪酸去饱和酶基因及其调控
• 1.5.2.3 ω-3 脂肪酸去饱和酶的生理功能
• 1.6 本研究的目的、意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 材料处理
• 2.1.3 菌株与质粒
• 2.1.4 酶及生化试剂
• 2.1.5 PCR 引物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 总RNA的提取
• 2.2.2 cDNA 第一条链的合成
• 2.2.3 cDNA 纯化
• 2.2.4 对cDNA 进行末端加尾
• 2.2.5 番茄ω-3去饱和酶基因全长的克隆
• 2.2.5.1 中间片段的获得
• 2.2.5.2 通过5’RACE获得5’端序列
• 2.2.5.3 通过3’RACE获得3’端序列
• 2.2.5.4 番茄ω-3去饱和酶基因全长的克隆
• 2.2.6 Northern杂交分析
• 2.2.6.1 总RNA的提取
• 2.2.6.2 甲醛变性胶电泳
• 2.2.6.3 转膜
• 2.2.6.4 预杂交
• 2.2.6.5 探针的制备
• 2.2.6.6 杂交
• 2.2.6.7 洗膜
• 2.2.6.8 放射自显影
• 2.2.7 Southern杂交
• 2.2.7.1 基因组DNA的提取
• 2.2.7.2 基因组DNA的限制性内切酶消化
• 2.2.7.3 转膜及烘膜
• 2.2.7.4 探针合成
• 2.2.7.5 预杂交、杂交及放射自显影
• 2.2.8 真核表达载体的构建
• 2.2.8.1 正、反义表达载体的构建
• 2.2.8.2 连接
• 2.2.8.3 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.8.4 转化及克隆筛选
• 2.2.8.5 碱法小量提取质粒DNA
• 2.2.8.6 质粒DNA的酶切鉴定
• 2.2.8.7 回收
• 2.2.8.8 DNA序列测定
• 2.2.8.9 根癌农杆菌LBA4404感受态细胞的制备与转化
• 2.2.8.10 利用农杆菌介导转化番茄
• 2.2.9 转基因番茄植株的PCR检测
• 2.2.9.1 CTAB法微量法提取基因组DNA
• 2.2.9.2 转基因植株的PCR筛选
• 2.2.10 ω-3脂肪酸去饱和酶的原核表达及Western杂交
• 2.2.10.1 原核表达载体的构建
• 2.2.10.2 E.coli BL21原核表达的诱导
• 2.2.10.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 2.2.10.4 抗体的制备
• 2.2.10.5 抗血清效价的测定
• 2.2.10.6 Western 杂交
• 2.2.11 转基因番茄生理指标的测定
• 2.2.11.1 转基因番茄叶片膜脂含量的测定
• 2.2.11.2 转基因番茄根系和叶片脂肪酸含量的测定
• 2.2.11.3 相对电导率的测定
• 2.2.11.4 呼吸速率的测定
• 2.2.11.5 放氧活性的测定
• 2.2.11.6 叶绿素荧光参数测定
• 2^-|-和H₂O₂的测定'>2.2.11.7 O₂^-|-和H₂O₂的测定
• 2.2.11.8 活性氧清除酶的活性测定
• 2.2.11.8.1 SOD酶活性的测定
• 2.2.11.8.2 APX酶活性的测定
• 2.2.11.8.3 丙二醛（MDA）含量的测定
• 2.2.11.9 扫描电镜样品的制作与观察
• 3 结果与分析
• 3.1 番茄内质网ω-3去饱和酶基因的分离及表达分析
• 3.1.1 LeFAD3基因的分离
• 3.1.2 LeFAD3基因的序列分析
• 3.1.3 LeFAD3基因在番茄中的表达分析
• 3.1.3.1 LeFAD3基因Southern杂交分析
• 3.1.3.2 LeFAD3基因在番茄不同器官中的表达
• 3.1.3.3 不同时间和不同温度下LeFAD3基因在番茄中的表达
• 3.1.4 LeFAD3基因在大肠杆菌中的表达
• 3.1.4.1 原核表达载体pET-LeFAD3的构建
• 3.1.4.2 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 3.2 LeFAD3 基因在番茄中的遗传转化
• 3.2.1 正、反义表达载体的构建
• 3.2.2 转正、反义LeFAD3基因植株的鉴定
• 3.3 LeFAD3基因的过量表达提高了番茄的抗冷能力
• 3.3.1 LeFAD3基因过表达改变膜脂脂肪酸的组成
• 3.3.2 LeFAD3基因过表达增加低温胁迫下植株的生长量
• 3.3.4 LeFAD3基因过表达对低温胁迫下呼吸速率的影响
• 3.3.3 LeFAD3基因过表达对低温胁迫下相对电导率的影响
• 3.3.5 LeFAD3基因过表达对低温胁迫下光合作用的影响
• 3.3.6 LeFAD3基因过表达对低温胁迫下根系和叶片细胞超微结构的影响
• 3.3.7 LeFAD3基因过表达对低温胁迫下叶片活性氧含量及抗氧化酶活性的影响
• 3.3.8 LeFAD3基因过表达对低温胁迫下叶片MDA含量的影响
• 3.4 抑制 LeFAD3 基因表达提高番茄的抗高温能力
• 3.4.1 抑制LeFAD3基因表达改变膜脂脂肪酸的组成
• 3.4.2 抑制LeFAD3基因表达对高温胁迫下植株的生长量的影响
• 3.4.3 抑制 LeFAD3 基因表达对高温胁迫下相对电导率的影响
• 3.4.4 抑制 LeFAD3 基因表达对高温胁迫下呼吸速率的影响
• 3.4.5 抑制LeFAD3基因表达对高温胁迫下光合作用的影响
• 3.4.6 抑制LeFAD3基因表达对高温胁迫下根系和叶片细胞超微结构的影响
• 3.4.7 抑制 LeFAD3 基因表达对高温胁迫下叶片活性氧含量及抗氧化酶活性的影响
• 3.4.8 抑制LeFAD3基因表达对高温胁迫下叶片MDA含量的影响
• 4 讨论
• 4.1 LeFAD3基因序列特征分析
• 4.2 过量表达LeFAD3显著提高番茄的耐冷性
• 4.3 抑制LeFAD3的表达显著提高番茄的耐热性
• 5 结论
• 6 参考文献
• 攻读学位期间撰写的论文
• 致谢