论文摘要
目的在肿瘤细胞中，TGF-β1对肿瘤细胞增殖起抑制作用，Smad4作为Smad通路中的核心因子，国内外研究表明其与肝癌发生有一定关系。TGF-β1／Smad4通路的信号转导异常在肝癌发病中起一定的作用。雌二醇（E2）主要在肝脏代谢和灭活，可以诱导肝原癌基因活化。雌激素受体（ER）调控基因表达，与肝癌发生、发展和预后有关。近年来非甾体类抗雌激素药物他莫昔芬应用于治疗肝癌，但治疗作用仍有争议，作用机制未明。他莫昔芬对其他肿瘤细胞TGF-β1、Smad4、ER的表达影响已经有报道，但他莫昔芬作用后上述指标在肝癌细胞表达的变化还没有比较系统的文献报道，本课题试图通过研究人不同浓度及作用时间的他莫昔芬对人肝癌HepG2细胞增殖及TGF-β1、Smad4、ER的表达的变化，探讨TGF-β1、Smad4、ER在肝癌发生中的机制及他莫昔芬治疗肝癌是否有效，并探讨其机制，为应用他莫昔芬治疗肝癌提供实验及理论基础。材料与方法将人肝癌HepG2细胞株常规培养于RPMI 1640培养液中（内含已用葡聚糖和活性炭去除了雌激素的10％小牛血清），培养液中加入青霉素（浓度100U／ml）和链霉素（浓度100μg／ml），在37℃、5％CO2培养箱中培养并进行传代。（1）观察不同浓度及作用时间的他莫昔芬对人肝癌细胞生长的影响：采用MTT测定光密度值（OD值），计算抑制率；（2）人肝癌细胞形态学观察：倒置相差显微镜及HE染色观察人肝癌细胞生长状况；（3）免疫组织化学染色（SP法）检测不同浓度他莫昔芬分别培养24h、48h和72h后，人肝癌细胞TGF-β1、Smad4、ER表达的变化。结果（1）他莫昔芬对人肝癌细胞抑制率的影响呈明显时间—浓度依赖(F时间=140.234，P时间=0.000；F浓度=44.031，P浓度=0.002)，时间的影响更明显。随着他莫昔芬作用时间延长，他莫昔芬对HepG2细胞的抑制作用不断增强，24h、48h、72h组之间相比差异均有统计学意义（均P＜0.05）；随他莫昔芬浓度增加，对HepG2细胞的抑制作用增强，不同浓度他莫昔芬组人肝癌细胞抑制率均较对照组明显增高（均P＜0.05），30μmol／L组72h抑制率最高；（2）倒置相差显微镜观察细胞体积减少，细胞变圆，细胞数目减少。HE染色显示细胞体积减少，细胞逐渐变圆，细胞核着色不均；（3）他莫昔芬对肝癌细胞TGF-β1的表达有促进作用，他莫昔芬对TGF-β1阳性率的影响呈明显时间—浓度依赖(F浓度=18.510，P浓度=0.010；F时间=34.144，P时间=0.003)，时间的影响更明显。24h、48h、72h组TGF-β1阳性率升高且有统计学差异（均P＜0.05）；不同浓度他莫昔芬对HepG2细胞TGF-β1的阳性率均有促进作用，人肝癌细胞TGF-β1的阳性率均较对照组明显升高（均P＜0.05），其中30μmol／L组72h TGF-β1阳性率最高；（4）他莫昔芬对Smad4阳性率的影响呈明显时间—浓度依赖(F浓度=16.062，P浓度=0.012；F时间=44.644，P时间=0.002)，时间的影响更明显。随他莫昔芬作用时间延长，其对HepG2细胞Smad4的表达的促进作用加强，24h、48h、72h组Smad4阳性率升高且有统计学差异（均P＜0.05）；不同浓度他莫昔芬对HepG2细胞Smad4的阳性率均有促进作用，且随浓度增加促进作用加强，人肝癌细胞Smad4的阳性率均较对照组明显升高（均P＜0.05），其中30μmol／L组72h ER阳性率最高；（5）他莫昔芬对ER阳性率的影响呈明显时间—浓度依赖(F浓度=27.992，P浓度=0.004；F时间=70.040，P时间=0.001)，时间的影响更明显。随他莫昔芬作用时间延长，其对HepG2细胞ER的表达的抑制作用加强，24h、48h、72h组ER阳性率下降且有统计学差异（均P＜0.05）；不同浓度他莫昔芬对HepG2细胞ER的阳性率均有抑制作用，且随浓度增加，抑制作用加强，人肝癌细胞ER的阳性率均较对照组明显降低（均P＜0.05），其中30μmol／L组72h ER阳性率最低；（6）他莫昔芬作用24h、48h、72h组TGF-β1、ER的表达均有负相关性（r=-0.993，P=0.037；r=-0.994，P=0.030；r=-0.991，P=0.003）。且7.5μmol／L组、15μmol／L组、30μmol／L组肝癌细胞TGF-β1、ER的表达均随药物作用时间变化发生变化，且具有负相关性（r=-0.999，P=0.012；r=-0.988，P=0.050；r=-1.000，P=0.004）；（7）24h、48h、72h组肝癌细胞Smad4、ER的表达具有负相关（r=-0.998，P=0.020；r=-1.000，P=0.008；r=-0.995，P=0.032）。且7.5μmol／L组、15μmol／L组、30μmol／L组肝癌细胞Smad4、ER的表达均随药物作用时间变化发生相关性变化，具有负相关（r=-0.998，P=0.022；r=-1.00，P=0.008；r=-0.992，P=0.041）；（8）24h、48h、72h组肝癌细胞TGF-β1、Smad4的表达具有正相关（r=0.998，P=0.017；r=0.993，P=0.038；r=0.999，P=0.011）。且7.5μmol／L组、15μmol／L组、30μmol／L组肝癌细胞TGF-β1、Smad4的表达均随药物作用时间变化发生变化，具有正相关（r=0.994，P=0.034；r=0.991，P=0.042；r=0.990，P=0.045）。结论1、他莫昔芬抑制肝癌细胞的增殖，呈浓度—时间依赖。2、他莫昔芬促进肝癌细胞TGF-β1的表达，呈浓度—时间依赖。3、他莫昔芬促进肝癌细胞Smad4的表达，呈浓度—时间依赖。4、他莫昔芬抑制肝癌细胞ER的表达，呈浓度—时间依赖。5、他莫昔芬通过影响肝癌细胞TGF-β1、Smad4及ER的表达抑制肝癌细胞生长。6、TGF-β1／Smad4信号传导通路异常及ER在肝癌发病中起协同作用。7、探讨了TGF-β1、Smad4、ER在肝癌发生中机制及他莫昔芬治疗肝癌的机制，为应用他莫昔芬肝癌提供实验及理论基础。
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