论文摘要
目的：通过构建TMEM43基因点突变真核表达载体，并将TMEM43基因点突变真核表达载体转染细胞，观察真核表达情况，同时采用生物信息学方法分析TMEM43基因的生物学功能，然后分析转染野生型与突变型TMEM43心肌细胞的细胞生长和细胞凋亡状况。方法：通过克隆PCR、酶切和定向连接等DNA重组技术构建真核表达质粒载体pTMEM43-EGFP-N1。表达载体pTMEM43-EGFP-N1用SDM定点突变技术构建TMEM43点突变真核表达载体p-mutTMEM43-EGFP-N1。将野生型和突变型TMEM43基因克隆分别转化DH-5α大肠杆菌感受态细胞，经卡那霉素抗性筛选阳性菌落，挑取阳性菌落，培菌扩增，小制备方法提取质粒DNA，并纯化质粒DNA。经Age I和Xho I单酶切或双酶切，根据酶切后DNA电泳结果剔除假阳性克隆。经酶切鉴定后的阳性克隆进行PCR测序反应，测序PCR反应产物经纯化后，用测序仪进行核苷酸测序。经测序的序列经比对后确认TMEM43基因点突变的发生。将测序证实的点突变克隆转化感受态细菌，扩菌后，用大提法制备去除内毒素的野生型和突变型跨膜蛋白TMEM43克隆质粒，备用。小鼠心肌细胞株HL-1细胞用含10%胎牛血清的Claycomb培养基培养，经胰蛋白酶消化和更新培养基后进行HL-1细胞的传代培养。用于显微观察的细胞贴附生长于小玻片上，应用Lipofectamine2000转染试剂，将野生型和突变型TMEM43分别转染HL-1细胞株，24小时后，在荧光显微镜下观察小玻片上HL-1细胞的质粒转染情况。用于蛋白免疫印迹分析的细胞，传代培养于培养皿中，细胞经转染后24-36小时，用细胞刮子收集贴附生长细胞，裂解液裂解细胞提取总蛋白。采用生物信息学的方法分析TMEM43蛋白质的与结构、点突变效应预测等。分别用MTT法和流式细胞术观察转染野生型和突变型TMEM43的HL-1细胞增殖和细胞凋亡情况。结果：1．构建的真核表达载体pTMEM43-EGFP-N1的酶切鉴定结果符合预期，即Age I和Xho I单酶切产生大小为5.7kb左右的线型DNA片断，而Age I和Xho I双酶切则产生大小分别为4.3kb和1.3kb的线型DNA片断。2．对含有野生型TMEM43基因的质粒pTMEM43-EGFP-N1通过定点突变技术，经突变诱导PCR后，经Dpn酶消化、细菌转化和筛选，对质粒DNA用Xho I限制酶消化，电泳后结果显示，突变体DNA产生清晰的大小为5.7kb的片断。3．将突变体转化感受态大肠杆菌后，接种于青霉素和卡那霉素双选培养板，经37℃孵育18小时后挑取阳性菌落。阳性菌落经液体培养基扩菌后，用小提质粒DNA方法提取质粒基因组DNA，经酶切后电泳结果显示有3个菌落符合预期。4．对符合预期的质粒进行测序鉴定，测序结果证实C>T的生成。5．经过酶切和测序鉴定证实的突变体p-mutTMEM43-EGFP-N1继续进行大量扩增和采用大提质粒DNA的方法提取不含内毒素和致热原的DNA，经酶切确认，再进行质粒全基因组测序，结果显示序列全部正确。6．应用Lipofectamine2000转染试剂分别用野生型TMEM43和突变型TMEM43质粒转染小鼠心肌来源的细胞株HL-1细胞，在荧光显微镜下观察到野生型和突变型均能够成功转染细胞，两者在在细胞内定位没有明显差异。7．对转染质粒后的细胞蛋白进行免疫印迹分析，结果显示，野生型和突变型TMEM43均有良好的表达。8．细胞增殖检测结果显示，野生型与突变型TMEM43转染细胞后，细胞增殖没有显著差异。9．流式细胞术检测分别转染野生型和突变型TMEM43基因的HL-1细胞，转染突变型的细胞凋亡水平显著高于转染野生型的细胞。蛋白质印迹分析结果显示，转染突变型TMEM43基因的细胞，凋亡相关蛋白Bax表达水平增加，而Bcl2蛋白表达水平降低。结论：1.在TMEM43基因中成功诱导产生了1073C>T点突变。2.构建的真核表达载体可有效转染真核细胞，转染突变型TMEM43可使细胞凋亡水平增加。3.转染突变型TMEM43可使凋亡相关蛋白Bcl2表达水平降低，Bax表达水平增加。
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相关论文文献
- [1].TMEM43基因SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用[J]. 西北民族大学学报(自然科学版) 2018(04)