酿酒酵母Png1p在酵母体内性质的研究

论文摘要

真核细胞内含有的peptide：N-glycanase（PNGase），简称为Png1p，是一种专门识别错误折叠的N连接糖蛋白，并将其糖链切除的糖苷酶。不同来源的Png1p的大小、结构有所差异，但都含有一个高度保守的核心催化区。其中酵母的Png1p是比较简单的一种。有证据表明Png1p在内质网偶联的糖蛋白降解途径（GERAD）过程中具有重要作用。但是对于其如何识别糖蛋白折叠正确与否，如何参与糖蛋白的降解过程目前还不清楚。此外人们对于Png1p对细胞的生理活动的影响情况也了解不多。为了了解上述问题，本实验作了两部分的工作。一部分工作是寻找酵母体内同Png1p相互作用的其他蛋白。有人通过GFP和Png1p融合表达发现酵母体内Png1p大部分分布在细胞质中，少数分布在内质网周围。定位不同的Png1p在去除糖链的具体过程中得作用还不是很清楚。对此有文献提出了几种假说。寻找Png1p同其他蛋白尤其是同内质网上的膜蛋白是否有相互作用就成为了解这一过程的关键。这部分实验通过一套新式的利用绿色荧光蛋白GFP作为报告基因的细菌双杂交系统来寻找同Png1p相互作用蛋白。一方面实验了几个可能或已知的同Png1p相互作用的蛋白，尤其是组成内质网易位子通道Sec61复合体的膜蛋白间是否有作用。另一方面通过构建酵母基因组文库来筛选未知的蛋白。最后验证了同Png1p存在相互作用的起DNA修复作用的Rad23p蛋白。没有发现Png1p同内质网易位子通道上的膜蛋白有相互作用削弱了上述的Png1p定位于内质网易位子通道的假说的可能性。另外一部分工作是研究酵母Png1基因的缺失对酵母生理功能的影响。利用一套可回收重复利用筛选标记基因的同源重组基因敲除系统：Cre-loxP系统，将KanMX筛选标记基因替换酵母Png1基因，达到基因敲除的目的。之后通过来源于噬菌体P1的环化重组酶Cre能够在loxP位点处识别和切割DNA，确保在两个分离的loxP位点间发生交叉重组，从而将loxP之间的KanMX抗性基因去除。为以后再敲除或插入其他基因提供了再次利用KanMX抗性基因的机会。对酵母的生理形态、生长情况、以及Rad23p的DNA修复功能的影响进行了研究。通过显微镜观察发现Png1的缺失对于酵母的生理形态没有显著影响；通过生长曲线的测定也没有发现Png1的缺失对于酵母的生长情况存在太大影响；此外通过紫外线诱变也没有发现Png1的缺失对于Rad23p的DNA修复功能存在影响。这些都说明Png1p在酵母体内不是必需的。从而也说明酵母体内可能还存在其他的糖蛋白降解过程。通过上述两部分实验初步研究了酿酒酵母Png1p在酵母体内的一些性质。为以后更深入的研究打下了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章.前言
• 1.1 糖蛋白介绍
• 1.1.1 糖蛋白的分类
• 1.1.2 糖蛋白的功能
• 1.1.3 糖蛋白的合成及代谢
• 1.2 Png1p介绍
• 1.2.1 Png1P的性质及结构
• 1.2.2 Png1p在体内作用机理的假设
• 1.3 蛋白质间相互作用的研究
• 1.3.1 研究蛋白质相互作用的常用方法
• 1.3.2 利用组装的 GFP作为报告基因的细菌双杂交系统
• 1.3.3 绿色荧光蛋白GFP及其突变体
• 1.4 基因敲除的研究
• 1.4.1 基因敲除的常用方法
• 1.4.2 Cre-loxP基因敲除系统
• 1.5 论文的目的及意义
• 第二章.酵母体内Png1p同其他蛋白质相互作用的研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 实验结果
• 2.2.2 结果讨论
• 第三章.酵母Png1 基因敲除的研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 实验结果
• 3.2.2 结果讨论
• 3.3 课题总结及展望
• 参考文献
• 致谢
• 学位论文评阅及答辩情况表