论文摘要
乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）属嗜肝DNA病毒科,是已知感染人类最小的DNA病毒。HBV感染不仅可以引起急、慢性肝炎,而且还与肝硬化、肝癌的发生、发展密切相关。自二十世纪六十年代HBV发现以来,通过转染肝细胞的方法对HBV的基因组成、复制、包装、分泌等过程了解的已比较清楚,但由于缺乏简单易得的体外感染细胞模型,HBV感染的早期机制如HBV的黏附、胞吞、脱壳等过程尚未得到阐明。HBV属包膜病毒,它的感染进入过程主要是HBV表面蛋白与HBV受体等宿主分子的互作过程。在HBV受体迟迟未能得到阐明的情况下,我们认为对HBV表面蛋白各个结构域在HBV侵染肝细胞过程中的作用进行鉴定是必要的,这不仅有利于深入理解HBV侵染肝细胞的机制,对HBV受体的发现以及基于HBV侵染机制的新型抗HBV药物的研发都具有重要的意义。现有HBV体外感染细胞模型所接种病毒一般采用了HBV本身或者HBV的卫星病毒丁型肝炎病毒（hepatitis delta virus,HDV）,两者广泛应用于HBV侵染肝细胞相关表面蛋白结构域的鉴定,但两者均无法考察对其包装分泌必需的结构域。最近,研究者将HBV表面蛋白与慢病毒载体共转染293T细胞成功包装了HBV假病毒（HBV pseudotype particles,HBVpp）,并证明HBVpp具有与HBV感染相似的机制。HBVpp的包装成功,为研究HBV表面蛋白进入相关结构域带来了新方法,因此本研究决定采用HBVpp和在我国较容易获取的树鼩原代肝细胞（primary tupaia hepatocytes,PTH）建立HBVpp-PTH体外HBV感染替代细胞模型,并尝试利用此模型对HBV表面蛋白的“preS2结构域、跨膜结构域I、跨膜结构域II、S结构域的Cys-107、L蛋白羧基端结构以及S蛋白”在HBV侵染肝细胞过程中的作用进行鉴定。首先,通过建立一种简易方便的肝原位两步灌注法成功分离得到PTH,每只动物的细胞得率达到1×108个左右,细胞活力平均在90%,平均贴壁率达到70%以上,并筛选出一种较好的PTH冻存配方,PTH冻存复苏后细胞贴壁率平均达到40%;然后通过将HBV表面蛋白质粒和慢病毒载体共转染293T细胞的方法进行了HBVpp的包装生产并对HBVpp感染特性进行了分析,发现HBVpp仅能感染对HBV易感的PTH,而对HBV不易感的大鼠原代肝细胞（primary rat hepatocytes,PRH）、HepG2和293T细胞对HBVpp同样不易感,并且preS1抗体能够特异性的阻断HBVpp感染PTH;其次利用建立的HBVpp-PTH模型考察了已知对HBV感染重要的豆蔻酰化修饰、不必要的M蛋白以及L蛋白的胞内区I在HBVpp感染中的作用,所得结论与文献利用HBV/HDV研究结论一致。以上结果充分表明HBVpp-PTH模型可以用于HBV侵染肝细胞相关表面蛋白结构域的鉴定研究。通过构建HBV表面蛋白结构域的系列缺失替换质粒并通过WB、ELISA的方法对这些重组蛋白的表达和分泌特性进行了分析,结果表明凡是含有preS1结构域的HBV重组表面蛋白均表达于细胞内而无分泌特性;对S蛋白的研究表明,跨膜结构域I、Cys-107、羧基端结构域的缺失和替换均会造成重组蛋白分泌特性的丧失或严重降低。HBV/HDV的包装生产依赖于S蛋白的分泌,因此这些结构域无法应用现有的HBV/HDV模型来进行研究。HBVpp的包装生产无特异性,仅需HBV表面蛋白分布于细胞膜即可。通过流式的方法对各种HBV重组表面蛋白在细胞膜的表达进行了分析,发现其均可以少量表达于细胞膜表面（部分表达量较高）。利用HBV重组表面蛋白质粒、慢病毒包装质粒和含eGFP基因的慢病毒载体共转染293T细胞的方法进行了各种HBVpp的包装生产并考察了其对PTH、PRH、HepG2和293T细胞的感染特异性,发现所有HBVpp对PRH、HepG2和293T细胞均无感染性,部分HBVpp可以感染PTH。根据感染性HBVpp包装所用HBV重组表面蛋白的特点,总结得出以下结论:1. preS2结构域的整体缺失不影响HBVpp的感染进入（但要达到最优感染效果需要preS1结构域羧基端氨基酸的共同缺失）。2.跨膜结构域I的存在对HBVpp的感染进入是必要的,但可以被无融合肽活性的其他跨膜结构域所替代,提示其在HBVpp进入中不起融合肽作用。3.跨膜结构域II对HBV表面蛋白的整体结构至关重要,现尚无法确定其在HBVpp感染进入过程中的作用。4. S结构域Cys-107对HBVpp的感染进入不是必要的。5. HBV表面蛋白羧基端21个氨基酸的缺失不影响HBVpp的感染进入。6. S蛋白对HBVpp的感染进入过程不必要,但其可以提高L蛋白在细胞膜的分布从而增强HBVpp的感染性,同时L蛋白的S结构域必须与preS1结构域位于同一条肽链上才能介导HBVpp的感染进入。随后对筛选出的具有结构域代表性和较高感染效率的HBVpp的滴度进行了测定,并利用感染抑制试验进行了进一步的反向验证,证明HBVpp的感染与HBV具有同样的preS1结构域依赖性。综上所述,HBVpp与HBV感染机制相似,采用HBVpp-PTH模型鉴定HBVpp侵染肝细胞相关HBV表面蛋白结构域所得上述结论应当适用于HBV自身。
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